[發(fā)明專(zhuān)利]香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表達(dá)載體及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210484294.4
• 申請(qǐng)日: 2022-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114752607B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐立;李志英;王加賓;陳瑩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/53
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/53;C12N15/82;C12N15/10;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 海口翔翔專(zhuān)利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 張耀婷

本發(fā)明公開(kāi)香蕉MtLUT5基因，提取“派露絲”香蕉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR方法獲得MtLUT5基因的全長(zhǎng)cDNA，與?Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans?T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆得到香蕉MtLUT5基因。測(cè)定了“派露絲”香蕉不同組織LUT5基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)生殖器官中的表達(dá)水平明顯高于營(yíng)養(yǎng)器官；測(cè)定了黑暗培養(yǎng)后AAA、BBB、TTT基因型香蕉組培苗表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)黑暗處理后AAA基因型LUT5表達(dá)水平提高，BBB基因型降低，TTT基因型香蕉轉(zhuǎn)錄組則不含LUT5基因。連接到植物表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建pBI121?MtLUT5重組載體。該基因會(huì)提高香蕉果肉類(lèi)胡蘿卜素總含量，導(dǎo)致β?胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、葉黃素、葉黃素癸酸酯含量上調(diào)，導(dǎo)致5,6環(huán)氧葉黃素?發(fā)酸酯?棕櫚酸酯、葉黃素油酸酯含量下調(diào)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及香蕉LUT5基因的克隆、表達(dá)特性分析、表達(dá)載體構(gòu)建、對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的調(diào)控作用。

背景技術(shù)

類(lèi)胡蘿卜素是保障人體營(yíng)養(yǎng)和健康最必需的成分之一，人類(lèi)自身無(wú)法合成，因此只能依賴(lài)于自然資源或者膳食補(bǔ)充劑。維生素A缺乏癥(VAD)是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在發(fā)展中國(guó)家最為嚴(yán)重。發(fā)展中國(guó)家80％以上的維生素A來(lái)源于植物維生素A原類(lèi)胡蘿卜素(pVACs)。香蕉是世界范圍內(nèi)一些最貧窮地區(qū)(包括非洲和亞洲)的淀粉類(lèi)主食，在解決發(fā)展中國(guó)家VAD方面變得越來(lái)越重要。香蕉果肉含有多種類(lèi)胡蘿卜素，其中主要積累的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素是維生素A的前體，可以降低人類(lèi)傳染病、精神障礙、視力喪失等殘疾的發(fā)病率和死亡率；葉黃素雖沒(méi)有維生素A活性，卻是具有能強(qiáng)力清除單態(tài)氧的抗氧化劑，能幫助清除自由基，減緩骨質(zhì)疏松。

目前，許多商業(yè)主栽品種，尤其是一些“卡文迪許”組的品種，pVAC含量較低，因此選擇“卡文迪許”組的“派露絲”香蕉(CN20120829.1A)展開(kāi)研究，以期獲得高類(lèi)胡蘿卜素香蕉。人類(lèi)食用的香蕉多為三倍體、單性結(jié)實(shí)，且生命周期較長(zhǎng)，通過(guò)傳統(tǒng)育種在香蕉中引入新性狀仍非常困難，最合適的策略是對(duì)已接受的品種進(jìn)行基因改造。LUT5調(diào)控植物高效生產(chǎn)葉黃素，同時(shí)限制α-胡蘿卜素的積累，且在弱光條件需要二者時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)CYP97A3酶生成葉黃素和α-胡蘿卜素。另外，LUT5對(duì)β-胡蘿卜素的β-環(huán)具有一定活性。但LUT5如何調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素含量和組成尚未可知。目前，也還沒(méi)有關(guān)于香蕉LUT5基因作用及其功能的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種香蕉MtLUT5基因香蕉MtLUT5基因，該基因序列具有序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明從“派露絲”葉片中分離出LUT5基因的全長(zhǎng)cDNA，并首次鑒定出MtLUT5具有促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素形成的功能。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種香蕉MtLUT5基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)以“派露絲”香蕉(AAA,Musa?spp.)葉片為材料，利用CTAB法提取總RNA：

(2)MtLUT5基因的克隆：

(2-1)利用TransScript公司的One-Step?gDNA?Removal?and?cDNASynthesis?SuperMix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR模板備用；

(2-2)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物；

(2-3)根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將獲得的產(chǎn)物連接Trans公司的克隆載體進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和PCR檢測(cè)后進(jìn)行序列測(cè)定。

進(jìn)一步地，步驟(1)總RNA的提取具體如下：

(1-1)在2mL無(wú)酶離心管中加入850μL?1x?CTAB，65℃水浴鍋中預(yù)熱；

(1-2)液氮倒入無(wú)酶處理過(guò)的研缽進(jìn)行預(yù)冷，派露絲香蕉葉片在液氮中充分研磨，研磨好的粉末加入CTAB前，加入20μLβ-巰基乙醇；