[發(fā)明專利]香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表達(dá)載體及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210484294.4
• 申請(qǐng)日: 2022-05-06
• 公開（公告）號(hào): CN114752607B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐立;李志英;王加賓;陳瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/82;C12N15/10;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 海口翔翔專利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 張耀婷

1.一種香蕉MtLUT5基因，其特征在于：該基因序列為序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2.一種權(quán)利要求1所述香蕉MtLUT5基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）以“派露絲”香蕉葉片為材料，利用CTAB法提取總RNA：

（2）MtLUT5基因的克隆：

（2-1）利用TransScript?One-Step?gDNA?Removal?and?cDNA?Synthesis?SuperMix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR模板備用；

（2-2）設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物；擴(kuò)增引物為MtLUT5?F引物和MtLUT5?R引物，序列分別如序列表中的SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示；

（2-3）根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將獲得的產(chǎn)物連接pEASY?-Blunt克隆載體進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和PCR檢測(cè)后進(jìn)行序列測(cè)定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉MtLUT5基因的克隆方法，其特征在于，步驟（1）總RNA的提取具體如下：

（1-1）在2?mL無(wú)酶離心管中加入850?μL?1x?CTAB，65℃水浴鍋中預(yù)熱；

（1-2）液氮倒入無(wú)酶處理過的研缽進(jìn)行預(yù)冷，派露絲香蕉葉片在液氮中充分研磨，研磨好的粉末加入CTAB前，加入20?μL?β-巰基乙醇；

（1-3）劇烈振蕩，渦旋30?s，65℃水浴加熱6?min；

（1-4）往離心管中加入850?μL、體積比24:1的氯仿：異戊醇，搖勻渦旋30?s后，4℃，11000?rpm離心15?min，管內(nèi)分成三層；

（1-5）小心吸取上層清液進(jìn)2?mL無(wú)酶離心管，再次加入850?μL、體積比24:1的氯仿：異戊醇，重復(fù)上述操作；

（1-6）吸取上層清液進(jìn)1.5?mL無(wú)酶離心管，加入350?μL?8M?LiCl，4℃沉淀5?h；

（1-7）沉淀完成后，4℃，11000?rpm高速離心30?min，棄上清；

（1-8）加入500?μL?70%乙醇清洗兩次沉淀后打開蓋子，室溫放置3-5?min晾干沉淀；

（1-9）吸取20-30?μL?DEPC水加入離心管，充分溶解沉淀RNA；

（1-10）吸取少量RNA進(jìn)行檢測(cè)，確定是否符合要求用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，RNA純度和濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)由分光光度計(jì)分析得到；完整性檢測(cè)結(jié)果由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得出；

（1-11）剩余RNA做好標(biāo)記后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.一種香蕉MtLUT5基因重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體包含目的基因，所述目的基因?yàn)闄?quán)利要求1所述的香蕉MtLUT5基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的香蕉MtLUT5基因重組表達(dá)載體，其特征在于：用權(quán)利要求1所述的香蕉MtLUT5基因插入到植物表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體。

6.一種權(quán)利要求1所述的香蕉MtLUT5基因在高類胡蘿卜素香蕉分子育種中的應(yīng)用。