[發明專利]檢測PDCoV的RT-RAA-LFD引物對、探針、試紙條、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210482181.0
• 申請日: 2022-05-05
• 公開（公告）號: CN114703179A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 張永寧;曾建宇;王文龍;周磊;蓋新娜;韓軍;郭鑫;楊漢春
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6844;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

本發明涉及動物疫病檢測技術領域，具體涉及檢測PDCoV的RT?RAA?LFD引物對、探針、試紙條、試劑盒及其應用。本發明以PDCoV的ORF1b基因為診斷靶標，設計、篩選、優化并最終獲得了能夠特異性檢測PDCoV核酸的引物對與探針。使用本發明的引物對、探針、試劑盒和試紙條可以實現對PDCoV的快速檢測，等溫擴增所得產物用核酸檢測試紙條檢測后直接進行結果判讀。整個檢測過程無需昂貴的儀器設備，僅通過肉眼判讀即可獲得檢測結果。本發明在基層和現場快速檢測與甄別PDCoV感染方面具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及動物疫病檢測技術領域，具體涉及一種檢測PDCoV核酸的RT-RAA-LFD引物對、探針、試紙條、試劑盒及應用。

背景技術

PDCoV是近年來新發現的一種豬腸道致病性冠狀病毒，主要感染新生仔豬，臨床癥狀表現為急性腹瀉、嘔吐、脫水和消瘦等，嚴重者發生死亡，已成為影響養豬生產的重要病原之一；盡管其他年齡階段的豬也可以感染，但癥狀相對輕微。PDCoV既可以通過健康豬直接接觸帶毒豬或患病豬的多種分泌物(如糞便、嘔吐物、唾液、乳汁、鼻腔分泌物和精液等)而發生感染，也可以通過間接接觸受病毒污染的飼料、器具、運輸工具和飼養員等而發生感染。2012年，Woo等從2007～2011年間采集的豬糞便拭子中首次測得PDCoV的全基因組序列。

已有研究表明，除了感染豬之外，PDCoV也能夠感染野鳥、雞、火雞、牛等不同種屬動物，說明該病毒具有潛在的跨物種傳播風險(Zhang J.,Virus Research,2016,226:71-84)。2021年，有研究從3名具有發熱和腹痛癥狀的海地兒童血液中分離出PDCoV，表明PDCoV具有潛在的公共衛生意義(Lednicky J.A.,Nature,2021,600:133-137)。

在分類上，PDCoV屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)。PDCoV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組結構為：5’UTR-ORF1a/1b-S-E-M-NS6-N-NS7-3’UTR，全長約25kb。其中ORF1a和ORF1b編碼兩個多聚蛋白pp1a和pp1ab，據推測，pp1a和pp1ab可被ORF1a/1b編碼的蛋白酶切割成約16個非結構蛋白，主要參與病毒復制與轉錄。鑒于PDCoV感染所導致的臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PRoV)等重要致豬腹瀉性病毒十分相似，因此確診PDCoV感染需要依靠實驗室檢測技術。目前，國內外主要依靠RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR和環介導等溫擴增(LAMP)等分子生物學方法以及間接免疫熒光、病毒中和試驗以及間接ELISA等血清學方法對PDCoV感染進行檢測與診斷。其中，RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR和LAMP等分子生物學檢測方法涉及到的診斷靶標包括S、M、N和ORF1等基因。盡管上述檢測方法在PDCoV的檢測與診斷中發揮了重要作用，但均普遍存在操作復雜、耗時長、對儀器設備要求較高或引物設計過于復雜等不足，難以滿足臨床上對PDCoV感染豬進行現場快速和可視化檢測的實際需求。

近年來，一種基于重組酶介導等溫核酸擴增(Recombinase-aidedamplification，RAA)技術在人醫和獸醫疾病診斷與檢測中正在顯示出良好的應用潛力，已經引起了全世界的廣泛關注。譬如，基于RAA與側向流免疫層析技術的病原體核酸檢測方法已經成功應用于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)和非洲豬瘟病毒(ASFV)的快速診斷，并已經申請了國家發明專利保護。RAA技術主要依靠單鏈DNA結合蛋白(通過與單鏈DNA結合，維持DNA的單鏈狀態，防止其重新配對形成雙鏈DNA)、重組酶(能與引物形成復合物，促進引物與模板DNA的同源序列配對，啟動DNA復制)和DNA聚合酶(用于擴增和延伸)在恒溫條件下(37～42℃)短時間內(≤20min)完成對目標核酸的擴增。