[發(fā)明專利]檢測PDCoV的RT-RAA-LFD引物對、探針、試紙條、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210482181.0
• 申請日: 2022-05-05
• 公開（公告）號: CN114703179A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永寧;曾建宇;王文龍;周磊;蓋新娜;韓軍;郭鑫;楊漢春
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6844;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

1.引物探針組合，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.16所示，所述探針的序列如SEQ ID NO.17所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述探針的5’端進(jìn)行生物素修飾，第32位堿基C被四氫呋喃(THF)替代，3’端進(jìn)行磷酸化修飾；反向引物的5’端進(jìn)行熒光基團(tuán)FAM修飾；

所述探針序列如下：

5’-Biotin-GGTCCAGAGTACCGCTGTGAGGAGCCGCTTG[THF]TAAATTAGTAGGAGT-Phosphorylation-3’

所述反向引物序列如下：

5’-FAM-ACGTGTTAGGAACATATTATGATACGCATC-3’。

3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述引物探針組合，在制備PDCoV的檢測試劑盒或檢測試紙條中的應(yīng)用。

4.一種PDCoV的RT-RAA-LFD檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的引物探針組合。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RT-RAA-LFD檢測試劑盒，其特征在于，所述RT-RAA-LFD檢測試劑盒還包括，反應(yīng)緩沖液和酶類。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的RT-RAA-LFD檢測試劑盒，其特征在于，所述酶類包括逆轉(zhuǎn)錄酶、重組酶、DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和核酸內(nèi)切酶IV。

7.一種PDCoV核酸的檢測試紙條，其特征在于，用于檢測權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述RT-RAA-LFD檢測試劑盒，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，所述檢測試紙條包括：樣品結(jié)合墊、檢測線、質(zhì)控線；所述樣品結(jié)合墊含有膠體金標(biāo)記的鏈霉親和素、檢測線(T線)含有鼠抗FAM的單克隆抗體、質(zhì)控線(C線)含有偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)的生物素。

8.權(quán)利要求7所述檢測試紙條的使用方法，其特征在于，包括：以待測樣品中提取的RNA為模板，使用權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述RT-RAA-LFD檢測試劑盒，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，采用所述檢測試紙條對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化判讀；

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：陽性結(jié)果出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測線(T線)，另一條位于質(zhì)控線(C線)；陰性結(jié)果僅在質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)一條紅色條帶，而在檢測線(T線)無紅色條帶出現(xiàn)；若僅檢測線出現(xiàn)紅色條帶，而質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，則為無效檢測結(jié)果。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為40℃恒溫擴(kuò)增10min。

10.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的引物探針組合或權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的RT-RAA-LFD檢測試劑盒或權(quán)利要求7所述的檢測試紙條在可視化判定PDCoV感染中的應(yīng)用。