[發明專利]同步檢測5種柑橘病毒的DPO RT-PCR引物組、檢測方法、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210476485.6
• 申請日: 2022-04-29
• 公開（公告）號: CN114790496A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 李戰彪;莫翠萍;謝慧婷;崔麗賢;陳錦清;林林;羅婉笛;李金哲;蔡健和;秦碧霞
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 南寧頌博遠信知識產權代理事務所(普通合伙) 45141
• 代理人: 蘭亞君

1.一種同步檢測5種柑橘病毒的OPO RT-PCR引物組，其特征在于，包括以下引物：

2條柑橘衰退病毒特異性引物：

DPO-CTV-F：5’-TGGCTCGTAGACACCIIIIICGTTCTCCGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

DPO-CTV-R:5’-CTAAGGAGAACTTCTTIIIIICACGCATACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

2條柑橘碎葉病毒特異性引物：

DPO-CTLV-F：5’-TGCTTCAACAAGCGAGGCIIIIICGGGTAGGAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

DPO-CTLV-R:5’-GTATAAAGGCAGGCATGTCAIIIIICAAGACCGCG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

2條柑橘裂皮病毒的特異性引物：

DPO-CEV-F:5’-CGGGATCTTTCTTGAGIIIIIIGTGGTGCT-3’，如SEQ ID NO.5所示；

DPO-CEV-R：5’-GCTCCTGTTTCTCCGCTGGIIIIIAGTGATCC-3’，如SEQ ID NO.6所示；

2條柑橘黃化脈明病毒特異性引物：

DPO-CYVCV-F：5’-TCCATTGTCGACGAGTIIIIICTAAGCCAG-3’，如SEQ ID NO.7所示；

DPO-CYVCV-R：5’-GGATAGCTGCGGTAGAGAGGGTIIIIGTAGTCGAAG-3’，如SEQ ID NO.8所示；

2條柑橘葉斑駁病毒的特異性引物，具體如下：

DPO-CLBV-F：5’-GGATTATGTGTCTCATGTIIIIIIAGAGACGG-3’，如SEQ ID NO.9所示；

DPO-CLBV-R：5’-TGCAGCTTTGAGTGACIIIIICAATTCTTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；

其中，I為次黃嘌呤。

2.一種檢測試劑或試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑或試劑盒包含權利要求1所述的OPO RT-PCR引物組。

3.一種同步檢測柑橘衰退病毒、柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黃化脈明病毒、柑橘葉斑駁病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取待測樣品，提取其總RNA，反轉錄為cDNA；

(2)采用權利要求1所述的OPO RT-PCR引物組，以待測樣品的cDNA為模板進行PCR反應，獲得擴增產物；

(3)使用瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物：如擴增到416bp大小的條帶，表明樣品中含有柑橘衰退病毒；如擴增到716bp大小的條帶，表明樣品中含有柑橘碎葉病毒；如擴增到187bp大小的條帶，表明樣品中含有柑橘裂皮病毒；如擴增到938bp大小的條帶，表明樣品中含有柑橘黃化脈明病毒；如擴增到576bp大小的條帶，表明樣品中含有柑橘葉斑駁病毒。

4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的反應體系為20μL，各引物的濃度為：引物DPO-CTV-F和引物DPO-CTV-R的濃度均為0.2μM，引物DPO-CTLV-F和引物DPO-CTLV-R的濃度均為0.1μM，引物DPO-CEV-F和引物DPO-CEV-R的濃度均為0.5μM，引物DPO-CYVCV-F和引物DPO-CYVCV-R的濃度均為0.3μM，引物DPO-CLBV-F和引物DPO-CLBV-R的濃度均為0.3μM。

5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的反應程序為：50℃30min，94℃5min；30個循環參數為：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。

6.權利要求1所述的OPO RT-PCR引物組在同步檢測柑橘衰退病毒、柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黃化脈明病毒、柑橘葉斑駁病毒中的應用。

7.權利要求2所述的檢測試劑或試劑盒在同步檢測柑橘衰退病毒、柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黃化脈明病毒、柑橘葉斑駁病毒中的應用。