[發明專利]一種以ACE2靶向遞送shRNA的ACE2siRNA藥物制備方法

在審

• 申請號: 202210473225.3
• 申請日: 2022-05-01
• 公開（公告）號: CN114870026A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 翁炳煥;王偉平;師越;俞光平;陳敏;楊艷梅;俞佳玲;王庭璋;楊昊堃;楊含金
• 申請（專利權）人: 杭州癡創生物科技有限公司
• 主分類號: A61K47/64
• 分類號: A61K47/64;A61K31/713;A61P31/14;C12N15/113
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一種以ACE2靶向遞送shRNA的ACE2siRNA藥物制備方法，從冠狀病毒保守基因或微衛星中篩選靶標siRNA，由兩條互補的正反義siRNA鏈合成帶loop環的小發夾shRNA，并合成以受體結合域RBD為配體的ACE2或穿胞肽ACE2，然后將ACE2分別連接到shRNA的正反義鏈上，合成由shRNA區和ACE2區構成的ACE2siRNA，其中雙價ACE2起中和RBD和靶向遞送shRNA的作用，以ACE2橋接的“shRNA?ACE2?RBD?病毒”復合物使shRNA隨著病毒的感染進入靶細胞，不但可避免將shRNA非特異性遞送給未感染細胞的副作用，而且還能產生抗變異毒株和以ACE2中和病毒的作用，另外以兩分子ACE2和1分子shRNA合成的ACE2siRNA及shRNA的免疫佐劑作用可使ACE2具有更強的抗原性，刺激機體產生的抗?ACE2又具有抗病毒作用。

技術領域

本發明涉及一種以ACE2靶向遞送shRNA的ACE2siRNA藥物制備方法，屬于傳染病防治的生物制藥領域。

背景技術

新型冠狀病毒的主要結構包括單股正鏈核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核殼蛋白(N)，其中S蛋白的N端由結構域(S1-NTD)和受體結合域(S1-RBD)組成，新型冠狀病毒通過其受體結合域S1-RBD與宿主細胞受體ACE2結合引起感染。

ACE2為I型跨膜糖蛋白，由805個氨基酸組成，包括跨膜區、胞內羧基端和胞外氨基端，冠狀病毒通過其S1-RBD與ACE2的細胞外催化結構域互動結合，導致細胞內吞、膜融合，使病毒進入表達ACE2或含有ACE2受體的細胞。

RNA干擾(RNAi)作為一種高效的序列特異性基因沉默技術，正在給疾病的治療帶來難以想象的應用前景，已有多種siRNA藥物被FDA審批上市。小干擾RNA(siRNA)大約21～23bp，以參與RNA干擾(RNAi)的方式調節基因表達,特異性降解與之互補的靶信使RNA(mRNA)，但無論是細胞水平還是活體內，使用siRNA進行基因干擾均要克服很多困難：1)膜通透性：siRNA帶有大量的負電荷，分子量大(～13KD)，自身很難穿過細胞膜，運輸siRNA主要靠化學修飾和一些運輸載體；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子構成，很容易被外界的RNA酶降解，如果在設計siRNA及選擇運輸載體時不對堿基進行特定的化學修飾或采取載體保護方法，則在siRNA進入作用位點前即被RNA酶降解；3)靶向遞送及載體：siRNA的作用位點主要在靶細胞漿內，所以需將siRNA特異性遞送給靶細胞漿，如果不能有效地選用合適的靶向遞送載體并及時使siRNA從內涵體釋放到胞漿，通?？杉せ罴毎庖叻磻?，導致干擾素等細胞因子的釋放，所以，如何有效地將siRNA運輸并釋放到靶細胞漿是影響RNAi效果的瓶頸問題，有些siRNA能導致序列或濃度依賴性非特異性基因沉默即脫靶，因此，在設計siRNA時，應同時考慮靶向遞送、基因抑制效果以及盡可能選擇低脫靶效應的序列。

在COVID-19的防治中，如果能以合適的靶向遞送載體將nCoVsiRNA穩定地、特異地依次遞送給靶器官、靶組織、靶細胞、定位于靶細胞、穿越靶細胞膜、釋放到靶細胞漿，并對多種變異毒株廣譜有效，就應能更好地開展COVID-19的靶向基因治療。

所以本發明要設計和合成以ACE2中和RBD及靶向遞送shRNA的廣譜抗病毒ACE2siRNA。

發明內容

本發明的目的是要提供一種以ACE2靶向遞送shRNA的ACE2siRNA藥物及其合成方法和用途，使雙價ACE2能與RBD結合而起中和病毒和靶向遞送shRNA作用，并使被ACE2靶向遞送的shRNA間接結合RBD而形成“shRNA-ACE2-RBD-病毒”的復合物，進而使shRNA被復合物靶向遞送，隨著病毒的感染進入靶細胞，起廣譜而靶向的抗變異毒株作用。

本發明的目的通過以下技術方案實施：

篩選共有基因：從數據庫記載的各種致病性冠狀病毒及其變異毒株中篩選不隨病毒變異而改變的共有基因，包括保守基因、超保守基因和/或保守微衛星。