[發明專利]一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法和應用

在審

• 申請號: 202210473176.3
• 申請日: 2022-04-29
• 公開（公告）號: CN114645049A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 陳守文;饒憶;蔡冬波;王佳琪;楊新愿
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于基因工程和分子生物技術領域，公開了一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法和應用。本發明的方法，其適用于地衣芽孢桿菌不同啟動子活性的改善。本發明以芽孢桿菌常用的組成型啟動子P43、PbacA和人工設計的強組成型啟動子R5為研究對象，得到新的啟動子P43^D、PbacA^D和R5^D。然后，以綠色熒光蛋白GFP為目的蛋白，研究發現，在地衣芽孢桿菌DW2中，與啟動子P43相比，啟動子P43^D使提高了GFP表達水平提高了6.20倍；與啟動子PbacA相比，啟動子PbacA^D使提高了GFP表達水平提高了2.50倍；而與啟動子R5相比，啟動子R5^D使提高了GFP表達水平提高了0.76倍。

技術領域

本發明涉及基因工程和分子生物技術領域，具體涉及一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法和應用。

背景技術

啟動子是位于編碼基因上游的一段特殊DNA序列，具有開啟基因轉錄的功能，并在調控基因轉錄水平中發揮著重要的作用。隨著合成生物學和蛋白表達平臺的蓬勃發展，人們逐漸發現，為了實現生物系統對目標產物的高產，強化靶蛋白基因表達水平是至關重要的。由于啟動子是基因轉錄的開關，并被認定為是建立基因高效表達工具的首選表達元件，從而啟動子優化是開發能強化靶蛋白基因表達水平技術的主選策略。目前，啟動子改造策略主要圍繞著σ因子識別和結合的啟動子核心區(-35區、核心間隔區、-10區)做改良工作。如王等人對T7啟動子核心區(-35區和-10區)進行組合，得到的最佳啟動子P21285提高了L-天冬酰胺酶和酸性脲酶在大腸桿菌中的產量(DOI:10.1002/biot.201800298)。

地衣芽孢桿菌是一個蛋白表達的平臺模式菌株，具有分泌蛋白能力強、生物安全性等特征，從而其可作為蛋白生產的優良宿主。目前，其已經實現多種蛋白高效生產，如α-淀粉酶、堿性蛋白酶，角蛋白酶等。然而，地衣芽孢桿菌在表達多數外源蛋白時，存在表達難或表達效率低的問題，而啟動子被認定為是建立基因高效表達工具的主要表達元件，且啟動子改造是開發能優化蛋白表達水平和代謝物代謝途徑技術的首選策略。

目前，地衣芽孢桿菌啟動子的改造主要是圍繞著核心區和5’-UTR做優化工作。比如，饒等人通過對不同σ因子識別的序列進行組合，以提高與RNA聚合酶結合效率，得到最優啟動子R2,發現其能有效提高綠色熒光蛋白GFP和角蛋白酶KER的表達量(ZL202010829306.3)。另外，肖等人通過優化P43的5’-UTR提高與RNA聚合酶結合效率，得到的最佳啟動子PUTR12能大幅度提高綠色熒光蛋白的表達水平(DOI:10.1021/acssynbio.9b00355)。

然而，目前并沒有人報道通過理性設計核心區二級結構來提高與RNA聚合酶的結合效率。

發明內容

本發明的目的是提供了一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法。

本發明的另一個目的在于提供了一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種基于核心區二級結構改造提高啟動子活性的方法，包括下述步驟：

1)對待改造的啟動子區域序列的二級結構進行預測；

2)基于步驟1)中所得的二級結構，分別替換和/或增添堿基以改變啟動子核心區的-35區和-10區的位置，使啟動子核心區的-35區和-10區在莖環結構的環上或是遠離莖環結構的核酸鏈上以利于和RNA聚合酶結合，既得新的核心區序列。

上述方法在提高啟動子活性中的應用，包括將調整后的啟動子，與待表達蛋白連接后轉入地衣芽胞桿菌中表達。

以上所述的應用中，優選的，所述的地衣芽胞桿菌為地衣芽孢桿菌DW2；