[發明專利]一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型及其制備與應用

在審

• 申請號: 202210472952.8
• 申請日: 2022-04-29
• 公開（公告）號: CN114908043A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 劉月華;李嬌;劉婷姣;張維華;劉雪
• 申請（專利權）人: 上海市口腔醫院（上海市口腔健康中心）
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/071;C12M3/00;C12Q1/02
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及肌肉芯片技術領域，尤其是涉及一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型及其制備與應用。本發明首先在聚四氟乙烯板表面設置通道層，得到陽模；再將聚二甲基硅氧烷灌注于陽模上，后處理得到陰模；利用硅膠材料制備與陰模相匹配的硅膠框架；然后將陰模與硅膠框架疊合，后處理得到肌肉芯片；最后將成肌細胞、細胞培養液與細胞外基質的替代物混勻得到混懸液，然后將混懸液置于預處理的肌肉芯片中誘導分化，通過精密控氧系統培養得到慢性間歇性低氧肌肉損傷模型。本發明采用微加工技術提供了一個新的研究平臺，模擬肌肉的核心組織結構，實現肌肉關鍵生理功能，并可以將其更有效的應用在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征研究中。

技術領域

本發明涉及肌肉芯片技術領域，尤其是涉及一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型及其制備與應用。

背景技術

頦舌肌是上呼吸道最主要的擴張肌，也稱為“上氣道安全肌”，其功能異常在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)的發病機制中占據重要位置。而OSAHS導致機體長期處于慢性間歇性低氧(CIH)狀態又進一步加重了頦舌肌損傷，形成惡性循環。如果能徹底或部分修復頦舌肌損傷，恢復其功能狀態，對于維持氣道通暢、提升OSAHS療效具有重要臨床意義。但由于臨床組織樣品取材困難等問題，如何評估不同程度CIH對人頦舌肌在功能和形態等方面的影響，成為OSAHS基礎研究領域亟需解決的關鍵問題。

目前針對OSAHS肌肉損傷的研究模型主要有傳統細胞2D培養模型，缺點是細胞貼壁生長，細胞極性消失，失去了體內組織3D結構特征，不能反映復雜微環境中細胞之間，細胞與基質之間的相互作用關系，并且所反映的生物學特性與體內真實的生理、病理狀況有一定的差異，更重要的是不能檢測肌肉的收縮功能；CIH小鼠模型是目前OSAHS基礎研究領域最常用的動物模型，但具有費用貴，耗時長，種屬差異大等不可抗力缺點。因此構建一種可有效反應體內組織結構和功能特點的肌肉模型，可為OSAHS肌肉損傷研究提供一個有效的技術平臺，從而加速這一領域的快速發展。

器官芯片(Organ-on-a-chip)是目前仿生人體器官最前沿技術之一，它堪稱是將醫藥、微流控、組織工程和細胞重編程/轉分化四大高新領域的重要集成，其核心是在體外構建器官的核心組織結構，實現器官的關鍵生理功能。無論在推進疾病體外模型發展，藥物篩選和評價領域具有劃時代的意義。器官芯片也越來越受到學術界、產業界和國家管理層面的認可。然而目前肌肉芯片平臺的搭建相對復雜，更多的是依賴特殊的儀器和設備，很難在一般實驗平臺進行應用和推廣。

發明內容

為了解決上述難題，本發明提供一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型及其制備與應用。本發明首先在聚四氟乙烯板表面設置通道層，得到陽模；再將聚二甲基硅氧烷灌注于陽模上，后處理得到陰模；利用硅膠材料制備與陰模相匹配的硅膠框架；然后將陰模與硅膠框架疊合，后處理得到肌肉芯片；最后將成肌細胞、細胞培養液與細胞外基質的替代物混勻得到混懸液，然后將混懸液置于預處理的肌肉芯片中誘導分化，通過精密控氧系統培養得到慢性間歇性低氧肌肉損傷模型。本發明采用微加工技術提供了一個新的研究平臺，模擬肌肉的核心組織結構，實現肌肉關鍵生理功能，并可以將其更有效的應用在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征研究中。

本發明通過微加工技術在聚四氟乙烯材料上制備兩個平行的啞鈴狀通道，從而獲得陽模；陽模灌注聚二甲基硅氧烷(PDMS)后，揭膜，可在PDMS上形成細胞可以尋址的圖案化基底，使得加入的成肌細胞、細胞培養液以及細胞外基質(ECM)的替代物混勻得到混懸液凝固后可以形成類似肌肉的形狀；之后在3D細胞的兩端放置硅膠框架作為細胞兩端的附著點，可為細胞生長提供特定方向的單軸機械張力；最后通過添加含有2％馬血清的培養基來誘導成肌細胞分化成為肌束。

本發明中肌肉芯片直接放置于小皿底部，無需封接。本發明的肌肉芯片經過紫外照射消毒后，先用0.2％-2％F-127預處理PDMS底面1小時，以防止細胞粘附。之后將成肌細胞、細胞培養液以及ECM的替代物以一定比例混合后接種于凹槽中；并在凹槽外面連接硅膠框架作為細胞兩端的附著點，為細胞生長提供特定方向的單軸機械張力。3D細胞常規培養3天后，更換含有2％馬血清的培養基來誘導成肌細胞分化形成肌束。