[發明專利]一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型及其制備與應用

在審

• 申請號: 202210472952.8
• 申請日: 2022-04-29
• 公開（公告）號: CN114908043A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 劉月華;李嬌;劉婷姣;張維華;劉雪
• 申請（專利權）人: 上海市口腔醫院（上海市口腔健康中心）
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/071;C12M3/00;C12Q1/02
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)陽模的制備：在聚四氟乙烯板表面設置通道層，得到陽模；

(2)陰模的制備：將聚二甲基硅氧烷灌注于步驟(1)制備得到的陽模上，后處理得到陰模；

(3)框架的制備：利用硅膠材料制備與步驟(2)得到的陰模相匹配的硅膠框架；

(4)肌肉芯片的制備：將步驟(2)制備得到的陰模與步驟(3)制備得到的硅膠框架疊合，后處理得到肌肉芯片；

(5)慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備：將成肌細胞、細胞培養液與細胞外基質的替代物混勻得到混懸液，然后將混懸液置于預處理的肌肉芯片中誘導分化，通過精密控氧系統培養得到慢性間歇性低氧肌肉損傷模型。

2.根據權利要求1所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述通道層為兩個平行啞鈴狀通道；

所述啞鈴狀通道包括連接通道以及連接通道兩側的端部通道；

所述通道的高度為1-2mm。

3.根據權利要求2所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述后處理為靜置過夜后烘干，然后冷卻、揭膜得到陰模；

所述陰模為存在的兩個平行啞鈴狀凹槽的聚二甲基硅氧烷板；

所述啞鈴狀凹槽包括連接凹槽以及連接凹槽兩側的端部凹槽；所述啞鈴狀凹槽與啞鈴狀通道相匹配；

所述聚二甲基硅氧烷板的長度和寬度分別與聚四氟乙烯板長度和寬度相同；

兩個平行啞鈴狀凹槽的高度為1-2mm。

4.根據權利要求3所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述硅膠框架為設置有方形孔洞的“回”字型框架；

所述方形孔洞的長度與連接凹槽長度相同；

所述方形孔洞與硅膠框架外側沿長度方向的距離與端部通道寬度相同；

所述方形孔洞的寬度比兩個啞鈴狀凹槽沿寬度方向的最遠距離大0.5-1.5mm；

所述硅膠框架高度為0.4-0.5mm。

5.根據權利要求1所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，疊合方式具體為將硅膠框架置于陰模有啞鈴狀凹槽的一側，并通過無菌針頭進行固定；

所述后處理為消毒處理。

6.根據權利要求1所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述預處理為將肌肉芯片浸入0.2％-2％F-127中以防止細胞粘附，靜置后吸干；

所述細胞培養液為體積分數為10％FBS的培養基；

所述細胞外基質的替代物包括Matrigel膠、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶；

成肌細胞、細胞培養液、Matrigel膠、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶的用量比為7.5×10⁵個：16-18μL：10μL：10μg：0.05U：0.08μg；

誘導分化過程中，誘導分化時間為7-14天。

7.根據權利要求1所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，精密控氧系統中，以低氧培養和常氧培養為一個循環，然后進行循環培養；

所述低氧培養過程中，保持培養環境中O₂含量為1-10％，CO₂含量為5％；

所述常氧培養過程中，保持培養環境中O₂含量為21％，CO₂含量為5％。

8.根據權利要求7所述的一種慢性間歇性低氧肌肉損傷模型的制備方法，其特征在于，每個循環中，保持低氧培養時間為30-40分鐘，保持常氧培養時間為20-30分鐘；

整個循環過程持續3-96h。

9.一種通過權利要求1-8任一所述的方法制備得到的慢性間歇性低氧肌肉損傷模型。

10.一種如權利要求9所述的慢性間歇性肌肉損傷模型在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征研究中的應用。