[發明專利]一種川貝母鱗莖組織培養再生方法

有效

• 申請號: 202210459866.3
• 申請日: 2022-04-28
• 公開（公告）號: CN114847159B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 張連娟;林亮;萬陽;袁萬立;王亞金;張方圓;張權
• 申請（專利權）人: 云南龍藏生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司 44425
• 代理人: 李國釗

1.一種川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

S1外植體處理：選川貝母鱗片作為外植體，消毒，備用；

S2胚性愈傷組織誘導：將S1處理后的鱗片接種至胚性愈傷誘導培養基中，在25±2℃下暗培養至形成胚性愈傷組織；

S3增殖培養：將S2中獲得的胚性愈傷組織按40g/L轉接至增殖培養基中，在25℃恒溫搖床上120r/min暗培養，每15日繼代1次，連續繼代4次；

S4分化培養：對S3中獲得的培養物離心去上清后，將留下的細胞團轉接至分化培養基中，在25℃恒溫搖床上120r/min暗培養，期間至少更換一次培養基，直至分化出直徑為1～2mm的體胚；

S5萌發培養：將S4獲得的體胚接種到體胚萌發培養基上進行萌發，先將體胚置于10℃下暗培養7～14日，然后再將其轉至培養條件溫度為20～25℃，光周期8/16h，光照強度1000～1500Lux的環境下進行培養至體胚發育成基部有白色粗根的乳白色小鱗莖；

S6植株再生：將S5中得到的已生根的小鱗莖從愈傷組織中分離并轉接到SH基礎培養基上繼續培養至小鱗莖分化抽芽，期間至少更換一次新鮮培養基，培養條件為20～25℃，光周期12/12h，光照強度2000Lux；

所述胚性愈傷誘導培養基以每升計算，其制備方法為：在SH培養基母液中加入1～2mg的2,4-D、0.5～1mg的6-BA、0.5～2mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至于一升，調節pH至5.8，最后加入2.5g的瓊脂；

所述增殖培養基以每升計算，其制備方法為：在SH培養基母液中加入1～2mg的2,4-D、0.5～1mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至一升，調節pH至5.8；

所述分化培養基以每升計算，其制備方法為：在SH培養基母液加入0.5～2mg的6-BA和45g的蔗糖后用水定容至一升，調節pH至5.8；

所述萌發培養基以每升計算，其制備方法為：在SH培養基母液加入0.5～2mg的6-BA和30g的蔗糖后用水定容至一升，調節pH至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的瓊脂；

所述SH基礎培養基以每升計算，其制備方法為：在SH培養基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，調節pH至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的瓊脂，所述SH培養基的配方為無水氯化鈣(CaCl₂₎151.02mg/L、七水合硫酸鎂(MgSO₄.7H₂O)400mg/L、硝酸鉀(KNO₃)2500mg/L、磷酸二氫銨(NH₄H₂PO₄)300mg/L。

2.根據權利要求1所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S5中，所述將體胚置于10℃下暗培養的時間為7日。

3.根據權利要求1所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S3中，所述胚性愈傷組織為從S2中形成的胚性愈傷組織中挑選的淺黃色、疏松呈顆粒狀的胚性愈傷組織。

4.根據權利要求3所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S3中，每個月用20目不銹鋼篩網對培養物進行過濾，保留直徑小于1mm的細胞繼續增殖培養。

5.根據權利要求1所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S2中，所述川貝母鱗片切成大小為0.5cm²的塊狀后再接種至胚性愈傷誘導培養基中。

6.根據權利要求1所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S1中，所述消毒方法為先在流水下對整個川貝母鱗莖進行涮洗，去掉表面粗皮和須根；隨后將鱗片由內而外分開，再用軟刷蘸取洗潔精對其進行涮洗后，最后在自來水下將洗潔精漂凈；將洗凈的鱗片放入無菌瓶并轉入超凈工作臺內，用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％HgCl₂浸泡8～15min，無菌水漂洗5～8次，用無菌濾紙吸干表面水分。

7.根據權利要求1所述的川貝母鱗莖組織培養再生方法，其特征在于：在步驟S4中，每7日更換一次培養基；在步驟S6中，每30日更換一次培養基。