[發(fā)明專利]以β-吲哚基丙氨酸為底物合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202210457985.5 | 申請(qǐng)日： | 2022-04-27 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN114875087B | 公開（公告）日： | 2023-08-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 趙云現(xiàn);楊志彬;胡江林;崔金旺;趙凱;展全樂 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 河北維達(dá)康生物科技有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12P13/06 | 分類號(hào)： | C12P13/06;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102 | 代理人： | 喬宇 |
| 地址： | 072154 河北*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 吲哚 丙氨酸 合成 羥基 方法 及其 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明提供了以β?吲哚基丙氨酸為底物合成5?羥基β?吲哚基丙氨酸的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的5?羥基β?吲哚基丙氨酸高產(chǎn)菌株，用于以β?吲哚基丙氨酸為底物生物法合成5?羥基β?吲哚基丙氨酸的方法，5?羥基β?吲哚基丙氨酸的合成產(chǎn)量高。本發(fā)明通過對(duì)BH4再生系統(tǒng)的構(gòu)建，新的BH4再生酶的挖掘，加強(qiáng)了工程菌株BH4的再生能力，尤其是雙BH4再生系統(tǒng)的同時(shí)作用，顯著提升了生物合成5?羥基β?吲哚基丙氨酸的產(chǎn)量。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以β-吲哚基丙氨酸為底物合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
5-羥基β-吲哚基丙氨酸廣泛存在于豆科植物的種子中，其中非洲植物加納的種子中含量最高。從加納籽中提取和精制5-羥基β-吲哚基丙氨酸的基本工藝路線為：加納籽粉碎—萃取—過濾離心—物理脫色—真空濃縮—結(jié)晶、重結(jié)晶—真空干燥。但隨著非洲加納樹數(shù)量不斷減少，傳統(tǒng)提取法獲得5-羥基β-吲哚基丙氨酸變得越來越困難，作為人體神經(jīng)代謝途徑中抵抗抑郁、緩解情感性精神障礙的天然藥物，近年來5-羥基β-吲哚基丙氨酸的市場(chǎng)需求越來越大，依靠天然產(chǎn)物提取己難以滿足市場(chǎng)需求，越來越多的企業(yè)開始從化學(xué)合成與生物發(fā)酵等方面研究5-羥基β-吲哚基丙氨酸的生產(chǎn)。
目前所報(bào)道的生物合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的合成方法，大部分是先合成β-吲哚基丙氨酸后再羥化其生成5-羥基β-吲哚基丙氨酸。β-吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已比較成熟。但是β-吲哚基丙氨酸羥化生成5-羥基β-吲哚基丙氨酸需要有BH4為輔因子參與才能進(jìn)行，而BH4難以儲(chǔ)存且價(jià)格昂貴，這使得通過額外添加BH4以工業(yè)化生產(chǎn)5-羥基β-吲哚基丙氨酸成為不可能。
而微生物中又沒有BH4的合成路徑，要想在微生物中合成則必須通過外源基因的加入。本發(fā)明通過對(duì)工程菌的BH4合成和再生能力的加強(qiáng)，并通過雙BH4再生系統(tǒng)的應(yīng)用，提高了5-羥基β-吲哚基丙氨酸的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為提供5-羥基β-吲哚基丙氨酸高產(chǎn)菌株、構(gòu)建以及以β-吲哚基丙氨酸為底物生物法合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
提供一種以β-吲哚基丙氨酸為底物生物法合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步驟：
1)利用所述的合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因或能夠表達(dá)合成β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因的重組基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸為底物，生物發(fā)酵合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸，所述的能夠表達(dá)合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因包括β-吲哚基丙氨酸產(chǎn)5-羥基β-吲哚基丙氨酸途徑關(guān)鍵酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2產(chǎn)BH4再生酶基因QDPR和BH2產(chǎn)BH4再生酶基因DHFR；
2)從1)的體系中分離得到5-羥基β-吲哚基丙氨酸。
按上述方案，PCD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，qBH2產(chǎn)BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6-10中任一序列所示；BH2產(chǎn)BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:11-15中任一序列所示。
優(yōu)選地，所述BH2產(chǎn)BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6，和SEQ?IDNO:8中任一序列所示；BH2產(chǎn)BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:11、SEQ?IDNO:12、SEQ?ID?NO:13、SEQ?ID?NO:14中任一序列所示。
更優(yōu)選地，所述BH2產(chǎn)BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示；BH2產(chǎn)BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:14所示。
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