[發明專利]以β-吲哚基丙氨酸為底物合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法及其應用

有效

• 申請號: 202210457985.5
• 申請日: 2022-04-27
• 公開（公告）號: CN114875087B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 趙云現;楊志彬;胡江林;崔金旺;趙凱;展全樂
• 申請（專利權）人: 河北維達康生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

1.一種以β-吲哚基丙氨酸為底物生物法合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)利用能夠表達合成β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因的重組基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸為底物，生物發酵合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸，所述的能夠表達合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因包括β-吲哚基丙氨酸產5-羥基β-吲哚基丙氨酸途徑關鍵酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2產BH4再生酶基因QDPR和BH2產BH4再生酶基因DHFR，PCD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，qBH2產BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示；BH2產BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQID?NO:14所示；

2)從1)的體系中分離得到5-羥基β-吲哚基丙氨酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：β-吲哚基丙氨酸產5-羥基β-吲哚基丙氨酸途徑關鍵酶基因TPH2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；

BH4合成途徑關鍵酶基因FOLE、PTPS、SPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2-4所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)為將所構建的重組基因工程菌經過活化培養后，轉接至發酵培養基誘導表達后，以β-吲哚基丙氨酸為底物轉化生成5-羥基β-吲哚基丙氨酸。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中將能夠表達合成β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因的重組基因工程菌分別經過LB培養基活化培養后，得到種子液，將種子液轉接至發酵培養基，發酵后加入IPTG誘導，并加入β-吲哚基丙氨酸，發酵轉化生成5-羥基β-吲哚基丙氨酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：種子液OD600＝5；

種子培養基按質量百分比計為1％胰蛋白胨、1％氯化鈉和0.5％酵母提取物；種子液的培養條件為28-40℃，160-230rpm；種子液接入發酵培養基的比例為1％-10％；

發酵培養基的組成按質量百分比計為：1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH₂PO₄和1.64％K₂HPO₄·3H₂O；

進行誘導前的發酵時間為1-5h；

IPTG的終濃度為0.1-10mM；

誘導表達的條件為16-37℃；

反應體系β-吲哚基丙氨酸濃度為1-50g/L；發酵時間為18-72h。

6.一種以β-吲哚基丙氨酸為底物生物法合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，其特征在于：包含合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因，所述的合成5-羥基β-吲哚基丙氨酸蛋白編碼基因包括β-吲哚基丙氨酸產5-羥基β-吲哚基丙氨酸途徑關鍵酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因，所述的BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2產BH4再生酶基因QDPR和BH2產BH4再生酶基因DHFR，PCD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，qBH2產BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示；BH2產BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:14所示。

7.一種權利要求6所述的工程菌的構建方法，其特征在于：β-吲哚基丙氨酸產5-羥基β-吲哚基丙氨酸途徑關鍵酶基因TPH2，BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR放入同一質粒串連表達；BH4再生酶基因PCD、QDPR、DHFR放入同一質粒串連表達；將上述質粒共同轉化至宿主細胞中，得到重組基因工程菌。