[發明專利]一種可以高精確度和敏感性識別豬偽狂犬病毒的納米抗體、制備方法和應用

有效

• 申請號: 202210457710.1
• 申請日: 2022-04-28
• 公開（公告）號: CN114736290B
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 駱璐;董春霞;費磊;陳忠瓊;凌洪權;歐陽吳莉;蔣佳利;姜東平;楊婭
• 申請（專利權）人: 重慶市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/558
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明提供一種可以高精確度和敏感性識別豬偽狂犬病毒的納米抗體，所述納米抗體靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的優選抗原表位融合蛋白，將其命名為PRV?BC21，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。通過對比試驗證明在PRV檢測中納米抗體PRV?BC21比商品化的單克隆抗體更靈敏，納米抗體PRV?BC21與膠體金標記技術相結合，靈敏度高，檢測PRV的檢測限可達到1ng/mL。特異性強，交叉反應少。首次開發的膠體金試紙條實現了快速檢測，將原本耗時兩天的免疫鑒別試驗縮短為幾分鐘完成的快速檢測，實現了對PRV快速檢測的初步應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種豬偽狂犬病毒(PorcinePseudoraibies?Virus，PRV)的特異性檢測方法，其活性單元為靶向豬偽狂犬病毒(PorcinePseudoraibies?Virus，PRV)gB和gC蛋白的納米抗體、制備方法和應用。

背景技術

豬偽狂犬病(Porcine?Pseudoraibies，PR)是豬的一種急性傳染病，又稱Aujeszky病，由豬偽狂犬病毒(Porcine?Pseudoraibies?Virus，PRV)引起。豬作為PRV的天然宿主，對病毒感染更為敏感，是可在急性感染中存活并具有潛伏感染力的唯一動物物種。感染后新生仔豬以高死亡率與神經系統紊亂為特征，懷孕母豬出現流產與繁殖障礙，老年豬以呼吸道疾病為主，以神經癥狀為特征的仔豬死亡率大于20％，豬感染野生型病毒的幾率高達50％，使我國養豬業損失巨大。

PRV屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)，α-皰疹病毒亞科(Alpha?Herpesvirinae)的成員，基因組為線性雙鏈DNA，大小約150kb。PRV目前已知的只有一種血清型，PRV共編碼70多種蛋白，主要蛋白除gG蛋白外，其余10個(gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN)均為囊膜結構蛋白。gB、gH、gL和gM蛋白在皰疹病毒科中比較保守，而且gB、gH和gL對所有皰疹病毒在細胞培養物中的復制都是必需的。gB蛋白能夠誘導中和抗體的產生，與免疫保護相關。gE蛋白最早被稱為gI蛋白。1960年篩選制備的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE基因缺失。20世紀80年代中期，通過DNA重組技術構建了gE基因缺失的PRV突變株；在此基礎上，將TK基因進行缺失使PRV病毒得到進一步弱化。許多gE基因缺失疫苗均能夠預防攻毒感染或減輕攻毒感染所造成的臨床癥狀，在許多國家允許豬群使用gE基因缺失疫苗。

從敏感性與特異性上來說，病毒的分離與鑒定是檢測PRV的黃金標準，但該分耗時長(至少2-3天)，且靈敏度較低，且需要較高的細胞培養水平，病毒培養過程也易出現細節性操作失誤而最終影響診斷結果，因此很難在基層獸醫單位得到推廣。病毒中和試驗(VNT)為PRV檢測中常用的方法之一，此方法高效且敏感。但是，在感染的急性階段此方法敏感性低，而且容易使結果呈現假陰性。間接夾心ELISA等免疫學診斷方法雖然具有很高的靈敏性和很強的特異性，但需要較多純度的蛋白，且需要精細操作且易出現假陽性，尤其依賴敏感性和特異性高的檢測抗體，可以說檢測抗體的性質就直接決定了檢測的準確性和精度。而且上述這些方法雖然可以檢測PRV病毒，在實踐中也取得一定的效果，但存在實驗操作復雜，耗時長，需要相互匹配的檢測試劑以及相關的儀器設備來進行，且僅限于在實驗室內進行，難以普及推廣。因此，研制開發快速、簡便的PRV病毒檢測方法，對于病毒增殖的實時監測具有重要意義。

發明內容

針對上述現有技術中的不足，本發明的目的是提供一種豬偽狂犬病毒(PorcinePseudoraibies?Virus，PRV)的快速特異性檢測方法，以解決上述現有技術存在的問題。

為實現上述目的，本發明提供一種可以高精確度和敏感性識別豬偽狂犬病毒的納米抗體，所述納米抗體靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的優選抗原表位融合蛋白，將其命名為PRV-BC21，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

進一步的，本發明提供一種納米抗體PRV-BC21的制備方法，包括以下步驟：