[發(fā)明專利]基因afsR_4突變及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210449351.5
• 申請日: 2022-04-26
• 公開（公告）號: CN114790436B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊晟;楊俊杰;蔣宇;錢源
• 申請（專利權(quán)）人: 泰興市東圣生物科技有限公司;上海東之匯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 賈師英

本發(fā)明公開了一種提高茂源鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能力的方法，其包括使茂源鏈霉菌基因組中的afsR_4基因功能失活或者下調(diào)表達(dá)。本發(fā)明的方法能夠顯著提升茂源鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量，具有工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種提高茂源鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能力的方法，尤其涉及通過改造茂源鏈霉菌的afsR_4基因來提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(EC?2.3.2.13，Glutamine?transaminase)又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase)，簡稱TGase或TG酶，是由331個氨基組成的分子量約38000的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)，在自然界中廣泛存在于人體、高級動物、魚類、植物和微生物中，例如大量存在于哺乳動物的各種組織器官(如肝臟、毛囊、表皮、前列腺、血液)。TG酶是一種?；D(zhuǎn)移酶，可通過催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，使蛋白質(zhì)多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價交聯(lián)。作為一種通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺作用形成共價化合物的聚合酶，其借助于兩個蛋白質(zhì)(包括乳清蛋白、麥胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽類肌動球蛋白等)之間的交聯(lián)反應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性、可攪拌性、熱穩(wěn)定性、乳化性等的功能特性。由于在食品、醫(yī)藥、紡織、皮革、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的用途，TG酶被稱為“21世紀(jì)的超級粘合劑”。

TG酶主要通過微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，所用的微生物是茂原鏈霉菌(Streptomyces?mobaraensis或者Streptomyces?mobaraense)，是我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760)中唯一合法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的安全菌株。

為了滿足越來越大的TG酶需求量，提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶量始終是本領(lǐng)域的技術(shù)追求。

發(fā)明內(nèi)容

我們在對泰興市東圣生物科技有限公司目前生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶中使用的工業(yè)菌株茂原鏈霉菌TDS0025進(jìn)行誘變選育過程中，篩選到一株發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活力提高幅度較大的突變菌株TDSM01。經(jīng)測序等研究分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶序列并沒有發(fā)生突變，酶活力提高的原因在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量提高。通過對原始菌株TDS0025與突變菌株TDSM01的比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其基因afsR_4的核苷酸序列由SEQ?ID?NO:1突變?yōu)镾EQ?ID?NO:2，即第1085位堿基由G突變?yōu)锳、第1401位堿基由C突變?yōu)門，第1409堿基A發(fā)生缺失。經(jīng)過進(jìn)一步的對比實驗研究，發(fā)現(xiàn)上述的突變導(dǎo)致了基因afsR_4的功能失活，有效地提升菌株的谷氨酰胺氨酶表達(dá)量?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

一種提高茂源鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能力的方法，包括下述步驟：使茂源鏈霉菌基因組中的afsR_4基因功能失活或者afsR_4基因下調(diào)表達(dá)。

上述afsR_4基因功能失活是指：afsR_4基因不表達(dá)原始的AfsR_4蛋白(tetratricopeptide?repeat?protein(三角形四肽重復(fù)蛋白，四三肽重復(fù)蛋白)，也稱Regulatory?protein?AfsR)，或者所表達(dá)蛋白的功能喪失或者活性降低。

其中，afsR_4基因的功能失活可以選自下組方式：核苷酸序列全部刪除，核苷酸序列部分刪除，基因突變，閱讀框內(nèi)突變終止密碼子。

上述基因突變可以發(fā)生在afsR_4基因的非編碼區(qū)和/或編碼區(qū)，選自下組方式：afsR_4基因的轉(zhuǎn)錄缺失；afsR_4基因的翻譯缺失；afsR_4基因的一個或多個密碼子的同義突變，導(dǎo)致高頻密碼子/常見密碼子/偏愛密碼子變成低頻密碼子/稀有密碼子/非偏愛密碼子；afsR_4基因的一個或多個密碼子的錯義突變，導(dǎo)致AfsR_4蛋白的活性降低或缺失；afsR_4基因讀碼框的移碼；它們中兩種以上的組合。