本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)糞便樣本中幽門螺桿菌耐藥基因突變?cè)噭┖校z測(cè)幽門螺桿菌23S rRNA基因2142、2143位點(diǎn)的A2142G、A2143G突變的引物探針，檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因87位點(diǎn)的N87I、N87K突變的引物探針，檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因91位點(diǎn)的D91N、D91Y、D91G突變的引物探針，檢測(cè)23S rRNA外控的引物探針，檢測(cè)gyrA外控的引物探針，DNA聚合酶，幽門螺桿菌陽(yáng)性質(zhì)控參考品和幽門螺桿菌陰性質(zhì)控參考品。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)多種突變位點(diǎn)的檢測(cè)，特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1％；非侵入性取樣，減少了患者的痛苦；實(shí)際組分改進(jìn)還增加了檢測(cè)效果的靈敏度和特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)糞便樣本中幽門螺桿菌耐藥基因突變?cè)噭┖小?/p>

背景技術(shù)

幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，H.pylori)是一種革蘭氏陰性菌，主要分布于胃黏膜組織中，其感染是胃炎最主要的致病因素，也是誘發(fā)胃癌的危險(xiǎn)因素，幾乎所有的Hp感染者均存在不同程度的胃黏膜炎癥。全世界有超過(guò)半數(shù)的人感染HP，而在我國(guó)的感染率為59％，因此根除Hp可以減少Hp相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。隨著根治Hp標(biāo)準(zhǔn)化治療的推廣和抗菌素的廣泛應(yīng)用，Hp的耐藥率逐年增長(zhǎng)，Hp根治失敗的幾率亦隨之增高。近年我國(guó)一個(gè)大規(guī)模的多中心臨床研究顯示，奧美拉唑、甲硝唑、克拉霉素三聯(lián)7天療程，Hp根除率僅65.9％。根治失敗的原因多種多樣，包括：抗菌藥物的選擇、患者服藥的依從性、區(qū)域因素、宿主因素、PPI劑量和代謝等諸多醫(yī)素。但細(xì)菌耐藥仍然是最主要原因，因此如何選擇抗菌素是根治Hp成功的關(guān)鍵。

已基本明確幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制是由于幽門螺桿菌的23S rRNA基因的V區(qū)(編碼肽酰轉(zhuǎn)移酶區(qū))發(fā)生點(diǎn)突變，核糖體構(gòu)象發(fā)生改變，抑制克拉霉素和幽門螺桿菌的結(jié)合，藥物不能阻止細(xì)菌蛋白合成，從而產(chǎn)生耐藥。左氧氟沙星主要作用于DNA螺旋酶，該酶通過(guò)暫時(shí)切斷DNA雙鏈，促進(jìn)DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的超螺旋松解，或使松弛的DNA鏈形成超螺旋空間構(gòu)型，左氧氟沙星通過(guò)嵌入斷裂DNA鏈中間，形成DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶-左氧氟沙星三者復(fù)合物，阻止DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化，阻止細(xì)菌DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。幽門螺桿菌對(duì)左氧氟沙星藥物耐藥機(jī)制主要與編碼DNA螺旋酶亞單位基因gyrA中左氧氟沙星藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)基因突變相關(guān)。

目前，用于幽門螺桿菌耐藥的方法主要有培養(yǎng)藥敏法，一代測(cè)序法，溶解曲線法，以PCR為基數(shù)的變性高效液相色譜的方法，PCR-FISH法。培養(yǎng)藥敏法需先進(jìn)行培養(yǎng)，然后再進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，步驟復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，且不容易培養(yǎng)出幽門螺桿菌。一代測(cè)序法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，對(duì)于突變頻率較低的樣本檢出率低，只能檢測(cè)10％以上的突變。PCR為基數(shù)的變性高效液相色譜的方法簡(jiǎn)單快速但只能提供樣本有無(wú)突變的信息，需要結(jié)合序列分析才能得出具體的突變類型。PCR-FISH發(fā)不能確定除了克拉霉素以外其他抗生素的耐藥性。以上方法都需要獲得患者的胃粘膜組織，胃鏡檢測(cè)對(duì)患者具有侵入性，引起患者的不適。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明期望提供一種檢測(cè)糞便樣本中幽門螺桿菌耐藥基因突變?cè)噭┖校僮骱?jiǎn)單，檢測(cè)效率高，靈敏度高且為非侵入性檢測(cè)，不會(huì)引起患者不適。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)糞便樣本中幽門螺桿菌耐藥基因突變?cè)噭┖校z測(cè)幽門螺桿菌23SrRNA基因2142、2143位點(diǎn)的A2142G、A2143G突變的引物探針，檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因87位點(diǎn)的N87I、N87K突變的引物探針，檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因91位點(diǎn)的D91N、D91Y、D91G突變的引物探針，檢測(cè)23S rRNA外控的引物探針，檢測(cè)gyrA外控的引物探針，DNA聚合酶，幽門螺桿菌陽(yáng)性質(zhì)控參考品和幽門螺桿菌陰性質(zhì)控參考品。

這里，所述檢測(cè)試劑盒以人糞作為檢測(cè)模板，非侵入性取樣，減少了患者的痛苦；采用擴(kuò)增阻遏方法，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)上述多種突變位點(diǎn)的檢測(cè)，使用簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1％。