[發(fā)明專利]一組檢測(cè)KRAS基因多位點(diǎn)突變的引物探針和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210446050.7
• 申請(qǐng)日: 2022-04-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116622843A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 虞閏六;宣文靜;任緒義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

本發(fā)明公開(kāi)了一組檢測(cè)KRAS基因多位點(diǎn)突變的引物探針和試劑盒，屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的檢測(cè)KRAS基因多位點(diǎn)突變的引物及探針能特異地?cái)U(kuò)增并檢測(cè)KRAS基因2、3、4外顯子多基因突變。本發(fā)明還公開(kāi)了一種基于多色數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測(cè)KRAS基因2、3、4外顯子多基因突變的檢測(cè)試劑盒，能實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)KRAS基因2、3、4外顯子多基因突變。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床KRAS基因2、3、4外顯子多基因突變的快速檢測(cè)，為臨床肺癌、結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)診斷和治療提供參考依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組檢測(cè)KRAS基因多位點(diǎn)突變的引物探針和試劑盒。

背景技術(shù)

近些年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的治療一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。隨著靶向治療藥物表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑西妥昔單抗(Cetuximab)和帕尼單抗(Panitumumab)的問(wèn)世，結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入了靶向治療時(shí)代。RAS家族是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的所有人類惡性腫瘤中最常見(jiàn)的突變之一。在正常細(xì)胞中，RAS蛋白可在胞內(nèi)信號(hào)傳遞的過(guò)程中起著連接的作用，它能夠?qū)⑸L(zhǎng)因子和細(xì)胞膜受體結(jié)合，從而調(diào)控細(xì)胞的生存。目前建議只有RA?S基因野生型的結(jié)直腸癌患者才能從抗表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)受體單克隆抗體的臨床治療中獲益。因此，在結(jié)直腸癌患者中進(jìn)行RAS基因突變的檢測(cè)，特別是KRAS和NRAS的檢測(cè)具有重要的臨床意義，其中以KRAS突變的頻率最高。

KRAS基因在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管生成等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑“下游區(qū)”的一種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)存活和分化等功能具有重要的影響。正常的KRAS基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而一旦發(fā)生突變，它就會(huì)持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，打亂生長(zhǎng)規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRA?S基因高度保持一致，并且KRAS基因狀態(tài)不會(huì)因治療而發(fā)生變化。因此檢測(cè)KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發(fā)展預(yù)后、放化療療效的重要指標(biāo)。

多個(gè)大樣本、多中心Ⅲ期臨床研究結(jié)果提示，KRAS基因2、3、4外顯子突變狀態(tài)與阻斷EGFR的單克隆抗體——西妥昔單抗、帕尼單抗的療效明確相關(guān)，KRAS野生型的患者可以從西妥昔單抗和帕尼單抗的治療中獲得最大化的生存效益。有文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)直腸癌患者中約30％～55％伴有KRAS基因突變，而且突變主要位于KRAS基因第2號(hào)外顯子的第12和13位密碼子，其中第12號(hào)密碼子位置突變占到80％以上。2013年歐洲癌癥大會(huì)上公布的FIRE-3最新數(shù)據(jù)顯示，在既往僅檢測(cè)KRAS基因突變熱點(diǎn)第2號(hào)外顯子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)了KRAS基因第3和4號(hào)外顯子突變，發(fā)現(xiàn)了16％的患者帶有KRAS第2號(hào)外顯子以外的突變，其中KRAS基因第3和4號(hào)外顯子的突變率約為11％。早在2009年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)即建議對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在選擇抗EGFR的單抗藥物(西妥昔單抗或帕尼單抗)治療前應(yīng)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)。2021版《結(jié)腸癌臨床實(shí)踐指南》中也明確指出，具有任何KRAS基因2、3、4外顯子突變的患者，不應(yīng)使用西妥昔單抗或帕尼單抗。