[發明專利]一組檢測KRAS基因多位點突變的引物探針和試劑盒

在審

• 申請號: 202210446050.7
• 申請日: 2022-04-26
• 公開（公告）號: CN116622843A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 虞閏六;宣文靜;任緒義
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

1.一組檢測KRAS基因多位點突變的核酸序列，其特征在于，包括如下引物對及探針，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：001～023所示，且核酸序列在一次1孔檢測中使用；

其中部分引物堿基前面的“+”號表示該堿基用鎖核酸LNA代替普通的核苷酸；SEQ?IDNO：3～9分別為檢測KRAS-2外顯子G12A、G12D、G12V、G12R、G12S、G13C、G13D突變型探針，序列的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ1淬滅基團；SEQ?ID?NO：12～16分別為檢測KRAS-3外顯子Q61R、Q61H1、Q61H2、Q61L、Q61K突變型探針，序列的5’端標記VIC熒光基團，3’端標記BHQ1淬滅基團；SEQ?ID?NO：19為檢測KRAS-4外顯子A146T突變型探針,序列的5’端標記ROX熒光基團，3’端標記BHQ2淬滅基團；SEQ?ID?NO：20為檢測KRAS-2外顯子G12C突變型探針,序列的5’端標記A425熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團；SEQ?ID?NO：23為檢測FECH單拷貝參考基因探針，序列的5’端標記CY5熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。

2.一組檢測KRAS基因多位點突變的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如下試劑：

(1)PCR反應液：包括DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP；

(2)引物探針預混合液：反應管所示的核苷酸序列的混合液，每條引物濃度為100uM，探針的濃度為100uM，配置10*mix預混液；

(3)陽性對照：包含KRAS基因3個外顯子4種突變型的質粒與正常基因組DNA(gDNA)的混合溶液；

(4)陰性對照：包含正常gDNA的溶液。

3.根據權利要求2所述用于檢測KRAS基因多位點突變的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照中，KRAS基因3個外顯子4種突變型的質粒拷貝數大于500拷貝/μL，內參基因拷貝數大于1000拷貝/μL。

4.根據權利要求2所述用于檢測KRAS基因多位點突變的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照中，內參基因拷貝數大于1000拷貝/μL。

5.一種權利要求1-4所述的檢測KRAS基因多位點突變的引物探針和試劑盒在檢測KRAS基因突變中的應用，其特征在于，包括以下步驟，

(1s)抽提血漿中的游離DNA或組織中的DNA；

(2s)用本發明所述試劑盒進行KRAS基因多重PCR檢測，檢測5個通道，同時檢測KRAS基因3個外顯子多位點突變，覆蓋97％以上的突變發生率；

(3s)將擴增完畢的PCR板放入讀取儀，對每一擴增完的樣本進行熒光分析，在陰陽性對照結果正常的前提下，分別計算樣本反應孔中KRAS基因突變的拷貝數與內參基因拷貝數，最終得出樣本中KRAS突變基因的準確狀態；

(4s)結果判讀：每次根據陰陽性對照設置閾值線。