[發明專利]一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202210442184.1
• 申請日: 2022-04-25
• 公開（公告）號: CN114807224B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 趙寶全;駱媛;馮元州;李前;王永安
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京專贏專利代理有限公司 11797
• 代理人: 劉梅

本發明涉及一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法及其應用，所述應用包括如下步驟：在育有可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型幼魚的培養液中，加入黑色素合成抑制劑，再分為加藥組和對照組，在加藥組加入待評價的調節膽汁酸代謝的藥物，繼續培養1天?4天；在熒光顯微鏡下觀察上述模型的斑馬魚的肝臟及腸道熒光情況，如果加藥組的熒光強度比對照組增強，則判定該調節膽汁酸代謝的藥物有效。本發明提出的可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型可用于評價調節膽汁酸、脂肪或葡萄糖代謝的藥物效果。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體為一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法及其應用。

背景技術

近年來，膽汁酸、脂肪、葡萄糖等代謝類藥物不斷涌現，各種膽汁酸、脂肪和葡萄糖等代謝研究如火如荼，但評價藥效的動物模型十分匱乏，雖然有致石性飼料制作的膽石癥鼠模型、高脂飲食制作肥胖鼠模型、糖尿病模型、轉基因鼠模型，但其是非自然狀態下的，并且個體差異很大，實驗數據靠大量推斷，重復性差，誤差很大。開發能夠直觀可見，實驗結果不用大量推斷就能判定的快速、直觀、靈敏、高效、高通量的評價模型十分必要。

法尼醇X受體(farnesoid?X?receptor,FXR)是核受體(nuclear?receptor,NR)超家族的成員。1995年，Forman等發現FXR能夠被法尼醇及其代謝物激活，因而得名。然而，在1999年人們發現膽汁酸才是FXR的真正內源性配體，所以又稱膽汁酸受體。目前已知的FXR基因有兩個，FXRα(NR1H4)和FXRβ(NR1H5)，FXRα從魚類到人類在進化上是保守的，它編碼四種FXRα亞型(FXRα1、FXRα2、FXRα3和FXRα4)，而FXRβ是人類和靈長類的假基因，其功能尚不清楚。FXR主要在肝、腸、腎和腎上腺等組織中表達，在脂肪組織和心臟中表達較少,此外,在胰島β細胞中也發現了FXR的存在。肝臟表達FXRα1/2和FXRα3/4，腸主要表達FXRα3/4亞型。FXR是多種代謝途徑的重要調節因子，包括膽汁酸、脂肪和葡萄糖代謝，最近的研究表明，FXR還在調節肝臟再生和抑制肝臟腫瘤方面發揮了關鍵作用。

近年來的流行病學調查顯示，膽石癥在成年人中的發病率10％～15％，歐美國家多于亞非國家，女性明顯多于男性，男女比例約為1:2.5，多發于40～60歲人群，隨著人口的老齡化、飲食結構的改變，其發病率還在逐年上升，所以膽石癥防治藥物研究尤其重要。目前膽石癥動物模型非常缺乏，以金黃地鼠，豚鼠等為模型，成功率低，耗時長，并且很難形成自身對照。

斑馬魚(Zebrafish)是近年來發展起來的模式生物，在毒理學和藥理學研究方面有其獨特優勢。1.斑馬魚胚胎和幼魚透明，易于在顯微鏡下實現活體觀察各種器官特征，熒光標記可以實現可視化的檢測；2.斑馬魚具有與人類高度相似的基因組，大多數斑馬魚的器官與人類的器官功能相似，生理功能與人類相近；3.斑馬魚繁殖能力強，發育快速，可以縮短藥物篩選的周期；4.斑馬魚產卵量大，適合高通量的藥物篩選。近年來，斑馬魚已廣泛應用于肝臟代謝相關的疾病研究中，如高脂血癥、酒精性脂肪肝、非酒精脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝炎和肝癌等，因其脂質成分、脂質吸收和脂質代謝過程與人類基本一致。

發明內容

為解決以上問題，本發明提供了一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法及其應用。

本發明利用法尼醇X受體作為細胞內膽汁酸水平的主要傳感器的機理，研發思路是將法尼醇X受體基因進行修飾，賦予熒光，構建斑馬魚模型，當與膽汁酸代謝相關的藥物作用后，在熒光表達上就會產生變化，既可以實現可視化的檢測。

本發明提供的可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法，包括如下步驟：

(1)通過網址http://genome.ucsc.edu/檢索斑馬魚法尼醇X受體基因調控序列，斑馬魚法尼醇X受體基因調控序列的名稱為nr1h4，利用Promoter?2.0軟件對上述調控序列nr1h4進行優化，設計并合成引物；