[發明專利]一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202210442184.1
• 申請日: 2022-04-25
• 公開（公告）號: CN114807224B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 趙寶全;駱媛;馮元州;李前;王永安
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京專贏專利代理有限公司 11797
• 代理人: 劉梅

1.一種可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）通過網址http://genome.ucsc.edu/檢索斑馬魚法尼醇X受體基因調控序列，斑馬魚法尼醇X受體基因調控序列的名稱為nr1h4，利用Promoter?2.0軟件對上述調控序列nr1h4進行優化，設計并合成引物；

（2）以斑馬魚基因組為模板，加入上述設計合成的引物，利用PCR方法釣取斑馬魚nr1h4調控序列，釣取獲得的斑馬魚nr1h4調控序列如SEQ?ID?NO:1所示；

（3）將釣取的斑馬魚nr1h4調控序列通過酶切連接構建于pT2AL200R150G轉座載體克隆位點，獲得轉座質粒pTol2-nr1h4-EGFP；

（4）將轉座質粒pTol2-nr1h4-EGFP與pCS-TP轉座酶mRNA共同注入野生型斑馬魚受精卵單細胞，孵化培養后，在熒光顯微鏡下篩選出在肝臟和腸道中特異性表達的熒光個體為F0代；所述熒光個體為陽性個體，即可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型；

（5）將上述F0代陽性個體與野生型斑馬魚雜交，篩選出F1代陽性個體；將F1代陽性個體再與野生型斑馬魚雜交，篩選出F2代陽性個體；在F2代陽性個體間進行雜交，篩選出陽性個體，再通過三代遺傳篩選，即獲得穩定遺傳的可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型Tg（-1.6nr1h4-EGFP）。

2.根據權利要求1所述可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型的構建方法，其特征在于，所述引物為：

上游引物:5'-?CGCGGATCCTGCAGCATCATGCTTGTGGAAG-3'；

下游引物:?5'-CCGCTCGAGTCATCGTGTGAACCACAATGCTC-3'。

3.權利要求1所述構建方法獲得的可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型在評價調節膽汁酸代謝的藥物效果上的應用。

4.根據權利要求3所述應用，其特征在于，包括如下步驟：

（1）在育有可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型幼魚的培養液中，加入黑色素合成抑制劑，再分為加藥組和對照組，在加藥組加入待評價的調節膽汁酸代謝的藥物，繼續培養1天-4天；

（2）在熒光顯微鏡下觀察上述模型的斑馬魚的肝臟及腸道熒光情況，如果加藥組的熒光強度比對照組增強，則判定該調節膽汁酸代謝的藥物有效。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述黑色素合成抑制劑為10-50mg/L的1-苯基-2-硫脲或30%的雙氧水。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，在觀察前將斑馬魚麻醉。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述可視化斑馬魚膽汁酸代謝模型幼魚的魚齡在加藥時為受精卵孵化后的第4天-10天。

8.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述熒光強度比對照組增強是指：熒光強度比對照組增強5%以上。

9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述麻醉斑馬魚的麻醉劑包括三卡因或巴比妥類麻醉劑。