[發(fā)明專利]一種GTF2H4高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞系

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210435411.8
• 申請(qǐng)日: 2022-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN115572730A
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李華;方哲彥;葛均波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/077
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

本發(fā)明公開了一種GTF2H4高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞系。本發(fā)明提供了一種攜帶有3xflag標(biāo)簽的GTF2H4DNA雙鏈片段，其序列如SEQ ID NO：4所示，本發(fā)明還提供了包含如SEQ ID NO：4所示的目的基因序列的表達(dá)載體和GTF2H4高表達(dá)微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，該細(xì)胞系能促進(jìn)HMEC?1在缺氧條件下的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力，抑制細(xì)胞的成管能力，此外，本發(fā)明利用PCR搭橋延伸技術(shù)構(gòu)建將3xflag標(biāo)簽融合入GTF2H4過(guò)表達(dá)重組載體中，這將有助于探索GTF2H4在內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中與其他關(guān)鍵分子的潛在互作機(jī)制；本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種GTF2H4高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞系，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIH(transcription factor IIH)是由10個(gè)亞單位組成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，參與了轉(zhuǎn)錄起始、DNA損傷修復(fù)、RNA剪切、調(diào)控細(xì)胞周期、招募其他轉(zhuǎn)錄因子等生物學(xué)過(guò)程。依據(jù)各亞單位的空間構(gòu)象、毗鄰關(guān)系及蛋白功能，TFIIH主要分為CORE核心區(qū)和具有周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)活性的激酶(cdk active kinase，CAK)亞復(fù)合體。而作為轉(zhuǎn)錄因子Tfb2家族的重要成員，TFIIH亞基4(generaltranscription factor IIH subunit4，GTF2H4)近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。GTF2H4主要與XPB相互作用，能夠穩(wěn)定XPB并輔助其發(fā)揮ATP酶活性，調(diào)控細(xì)胞周期；與其他亞基一起，GTF2H4參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程。目前已有研究發(fā)現(xiàn)GTF2H4在心肌梗死以及心肌缺血再灌注的過(guò)程中發(fā)生時(shí)程性變化，這提示GTF2H4可能參與了缺氧或者氧化應(yīng)激的微環(huán)境誘導(dǎo)的病理過(guò)程。

內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Endothelial to Mesenchymal Transition,EndMT)是指內(nèi)皮細(xì)胞在TGF-β誘導(dǎo)、氧化應(yīng)激、缺氧等因素的作用下喪失細(xì)胞間緊密連接，內(nèi)皮特異性標(biāo)記物表達(dá)減少，而逐漸獲得間充質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)記物，降解基底膜遷移至血管周圍環(huán)境的過(guò)程。內(nèi)皮間質(zhì)化不僅在胚胎心血管生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，也參與了動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、肺動(dòng)脈高壓等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在心、肺、腎等器官纖維化中都有被證實(shí)其扮演著關(guān)鍵的角色。而當(dāng)前針對(duì)內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究尚不成熟，其發(fā)生的潛在分子機(jī)制還有待被挖掘，新的靶點(diǎn)亟待被發(fā)現(xiàn)以應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮間質(zhì)化，從而改善心血管疾病。內(nèi)皮間質(zhì)化可于缺氧缺血誘導(dǎo)下發(fā)生的事實(shí)提示了GTF2H4極有可能在缺氧或氧化應(yīng)激微環(huán)境與內(nèi)皮間質(zhì)化有關(guān)聯(lián)。當(dāng)前未見有關(guān)GTF2H4基因在促進(jìn)內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在構(gòu)建一種GTF2H4高表達(dá)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了攜帶有3xflag標(biāo)簽的GTF2H4 DNA雙鏈片段，其序列如SEQ ID NO：4所示。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體包含如SEQ ID NO：4所示的目的基因序列。

優(yōu)選地，所述的表達(dá)載體選自病毒、真菌或細(xì)菌表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了一種包含上述的表達(dá)載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞為人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1。

本發(fā)明還提供了一種重組慢病毒表達(dá)載體的制備方法，包括：將慢病毒載體pHBLV-CMV-MCS-EF1-NEO通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI酶切后，將SEQ ID NO：4所示的DNA雙鏈片段克隆至酶切后的慢病毒載體，得到重組慢病毒載體。

本發(fā)明還提供了一種GTF2H4高表達(dá)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟：