[發明專利]斑塊狀角膜營養不良動物模型及基因治療載體的構建方法和遞送體系

在審

• 申請號: 202210435343.5
• 申請日: 2022-04-24
• 公開（公告）號: CN114774470A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 謝立信;張碧凝;周慶軍;戚本祥
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學附屬眼科研究所（山東省眼科研究所;山東第一醫科大學附屬青島眼科醫院）
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/10;A01K67/027;A61K48/00;A61K38/45;A61P27/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發明提供了斑塊狀角膜營養不良動物模型及基因治療載體的構建方法和遞送體系，涉及模型構建技術領域。本發明的動物模型通過前房注射的方式在角膜內皮中敲除動物Chst5基因實現，或通過Chst5R50H點突變實現，相比于目前存在的動物模型，眼部癥狀與臨床相似度更高。本發明還提供了一種基因治療載體，通過向前房中注射腺相關病毒載體攜帶野生型小鼠Chst5基因實現。在本發明實施例中，通過向上述小鼠模型的前房中注射上述基因治療載體，可實現斑塊狀角膜營養不良的治療。

技術領域

本發明屬于模型構建技術領域，具體涉及斑塊狀角膜營養不良動物模型及基因治療載體的構建方法和遞送體系。

背景技術

角膜營養不良是一類遺傳性的角膜疾病，多于青年時期發病，隨年齡增長角膜渾濁程度逐漸增加，最終會喪失視力。對角膜營養不良目前尚無有效的藥物治療方式，對累及淺表層的角膜營養不良可進行病變部位角膜切除術，對病變累及角膜深層的病人只能施行角膜移植。斑塊狀角膜營養不良為雙眼發病，發病多于10歲左右，主要影響角膜基質層，在進行角膜移植后仍有復發可能，對病人的生活會造成嚴重困擾。斑塊狀角膜營養不良為單基因隱性遺傳病，致病基因為CHST6。如果可以找到致病基因的功能代償方式，就為斑塊狀角膜營養不良的臨床基因治療的發展提供了可能性。

目前斑塊狀角膜營養不良最主要的治療手段依然為手術治療。主流的手術治療方式主要有兩種，全層角膜移植手術和前角膜深層移植手術，但角膜移植后都有一定的復發風險。

在基因治療方面，角膜營養不良的動物模型十分稀缺，對于開展基因治療的研究產生了阻礙。雖然斑塊狀角膜營養不良的致病基因十分明確，但該基因突變位點十分多樣化，使得針對單一位點的基因治療難以廣泛適用。在干細胞治療方面，研究人員從一位51歲女性斑塊狀營養不良患者尿液中分離出了攜帶CHST6突變的尿源性干細胞，并誘導成多能干細胞，以期將來應用于自體干細胞治療。在酶替代療法方面，研究人員將重組人氮乙酰半乳糖6硫酸鹽硫酸酯酶靜脈注射到粘多糖貯積病小鼠中，部分緩解了粘多糖在組織中貯積的情況，但該方案尚未用于角膜病治療中。綜上所述，斑塊狀角膜營養不良的除手術治療外的新治療手段尚未得到有效發展。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供斑塊狀角膜營養不良動物模型及基因治療載體的構建方法和遞送體系，構建得到更符合臨床眼部癥狀表現的模型，且所述基因治療載體可有效減緩和消除斑塊狀角膜營養不良的癥狀。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了斑塊狀角膜營養不良動物模型的制備方法，包括以下步驟：以前房注射的方式，敲除動物角膜內皮的Chst5基因或將Chst5基因的第二外顯子149位核苷酸由G突變為A。

優選的，所述動物包括小鼠，小鼠源的Chst5基因登錄號為NM_019950。

優選的，所述敲除的方法包括針對所述Chst5設計shRNA序列，將所述shRNA序列插入腺相關病毒載體的BsmBI限制酶剪切位點處，構建腺相關病毒敲除質粒，將所述腺相關病毒敲除質粒注射至小鼠前房中。

優選的，所述腺相關病毒載體為AAV九型載體。

優選的，所述shRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優選的，所述突變的方法包括CRISPR-Cas9基因編輯方法；

利用CRISPR-Cas9基因編輯方法進行點突變時，設計gRNA并構建帶有點突變的同源模板Donor。

優選的，所述gRNA包括Chst5-g1和Chst5-g2，其中Chst5-g1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述Chst5-g2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述同源模板Donor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。