[發明專利]斑塊狀角膜營養不良動物模型及基因治療載體的構建方法和遞送體系

在審

• 申請號: 202210435343.5
• 申請日: 2022-04-24
• 公開（公告）號: CN114774470A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 謝立信;張碧凝;周慶軍;戚本祥
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學附屬眼科研究所（山東省眼科研究所;山東第一醫科大學附屬青島眼科醫院）
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/10;A01K67/027;A61K48/00;A61K38/45;A61P27/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

1.斑塊狀角膜營養不良動物模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以前房注射的方式，敲除動物角膜內皮的Chst5基因或將Chst5基因的第二外顯子149位核苷酸由G突變為A。

2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，所述動物包括小鼠，小鼠源的Chst5基因登錄號為NM_019950。

3.根據權利要求1或2所述制備方法，其特征在于，所述敲除的方法包括針對所述Chst5設計shRNA序列，將所述shRNA序列插入腺相關病毒載體的限制酶剪切位點處，構建腺相關病毒敲除質粒，將所述腺相關病毒敲除質粒注射入小鼠前房中。

4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述腺相關病毒載體為AAV九型載體。

5.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述shRNA序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

6.根據權利要求1或2所述制備方法，其特征在于，所述突變的方法包括CRISPR-Cas9基因編輯方法；

利用CRISPR-Cas9基因編輯方法進行點突變時，設計gRNA并構建帶有點突變的同源模板Donor。

7.根據權利要求6所述制備方法，其特征在于，所述gRNA包括Chst5-g1和Chst5-g2，其中Chst5-g1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Chst5-g2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述同源模板Donor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一種斑塊狀角膜營養不良的基因治療腺相關病毒載體，其特征在于，所述基因治療腺相關病毒載體以腺相關病毒載體為基礎載體，在所述基礎載體上插入小鼠源的Chst5基因。

9.根據權利要求8所述基因治療腺相關病毒載體，其特征在于，所述基因治療腺相關病毒載體為攜帶小鼠源野生型的Chst5基因的AAV九型載體。

10.根據權利要求7或8所述基因治療腺相關病毒載體，其特征在于，所述基礎載體的結構包括：啟動子，多克隆位點，包含或不包含熒光標記基因。