[發明專利]一種雙酚AF半抗原的制備方法及應用

有效

• 申請號: 202210432571.7
• 申請日: 2022-04-24
• 公開（公告）號: CN114524726B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 邵兵;姚凱;張晶;尹杰;楊蘊嘉
• 申請（專利權）人: 北京市疾病預防控制中心
• 主分類號: C07C65/24
• 分類號: C07C65/24;C07C51/09;C07K14/435;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K16/44;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京中知星原知識產權代理事務所(普通合伙) 11868
• 代理人: 王維佳

1.一種雙酚AF半抗原，其特征在于，結構如下式(I)所示：

（I）。

2.根據權利要求1所述的雙酚AF半抗原的制備方法，其特征在于，合成路線如下：

。

3.根據權利要求2所述的雙酚AF半抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(S1)將雙酚AF用氫化鈉處理后，加入4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯，反應結束后，萃取，層析柱純化得中間體；

(S2)所得中間體先在堿性條件下進行水解，再用酸調節至酸性，反應結束后萃取，干燥即得。

4.根據權利要求3所述的雙酚AF半抗原的制備方法，其特征在于，步驟(S1)中，雙酚AF和4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯的摩爾比為1:1-1.2。

5.根據權利要求3所述的雙酚AF半抗原的制備方法，其特征在于，步驟(S1)中，所述氫化鈉處理是雙酚AF用氫化鈉處理是將雙酚AF溶于DMF后，冰浴條件下加入氫化鈉，待不再有氣泡冒出時撤去冰浴，在15-30℃反應0.5-1h，雙酚AF 和氫化鈉的摩爾比為1：1.1-2；

步驟(S1)中，所述萃取是反應液加入到水中，再用加入乙酸乙酯萃取，萃取操作重復1-2次；

層析柱純化是樣品上樣硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯按照體積比1-2:1-2的混合溶劑作為淋洗劑，收集目標產物，旋干溶劑即得中間體；

步驟(S2)中，堿性條件是加入堿，所述堿為氫氧化鈉，堿的加入量是中間體的1.5-2倍當量；

所述調節pH為酸性是調節pH為2-3，酸為鹽酸；所述萃取是加入乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃中的至少一種進行萃取。

6.一種雙酚AF人工抗原，是權利要求1所述式(I)的雙酚AF半抗原經過活化后，和載體蛋白偶聯，經過透析、離心得到，所述雙酚AF人工抗原如下式(II)所示：

(II)。

7.根據權利要求6所述的雙酚AF人工抗原，其特征在于，所述活化是加入EDC和NHS，在15-25℃，避光條件下活化15-30h；所述半抗原、EDC和NHS的摩爾比為1：2-3：2-3；

所述雙酚AF半抗原和載體蛋白的摩爾比為10-30:1，所述載體蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲狀腺蛋白、血匙藍蛋白或卵清蛋白；

偶聯反應條件是溫度15-25℃，pH為6-8，反應時間12-24h；

所述雙酚AF人工抗原的偶聯比為6-9。

8.一種雙酚AF單克隆抗體，其特征在于，用權利要求6所述式(II)所示的雙酚AF人工抗原免疫動物，抗血清篩選，細胞融合和篩選，細胞克隆，純化后得到BPAF單克隆抗體。

9.一種免疫親和柱，其特征在于，通過包括以下步驟制備方法得到：制備活化基質，活化基質，和權利要求8所述的雙酚AF單克隆抗體偶聯，洗滌，裝柱。

10.一種檢測痕量雙酚AF的方法，包括以下步驟：待測樣品經過前處理后，進行權利要求9所述的免疫親和柱的凈化，凈化樣品用UPLC-MS/MS法檢測。