[發明專利]檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組及其微滴式數字PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202210429231.9
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114622040A
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 陳麗婷;周劍峰;顧佳;肖敏;曹陽;黃亮
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 胡鎮西;馮超

本發明公開了一種檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組及其微滴式數字PCR試劑盒。本發明基于人巨細胞病毒保守的AD169基因組中編碼即刻早期轉錄調節蛋白的基因序列設計特異性引物及MGB水解探針，從而得到微滴式數字PCR試劑盒，本發明通過提取糞便上清游離DNA和微滴式數字PCR試劑盒檢測糞便中人巨細胞病毒的拷貝數，對輔助臨床診斷患者是否患有CMV腸炎的疾病有重要指導意義。

技術領域

本發明涉及病毒核酸檢測領域，具體涉及一種檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組及其微滴式數字PCR試劑盒。

背景技術

異基因造血干細胞移植是多種血液系統疾病的重要治療方式，移植后的患者經常會出現胃腸道癥狀，最有可能由急性移植物抗宿主反應和CMV腸炎引起，作為異基因造血干細胞移植術后的兩種常見嚴重并發癥，難以鑒別診斷，而針對兩種不同的并發癥臨床采取的治療方式截然不同，明確診斷并采取積極治療措施與異基因造血干細胞移植的成功與否密切相關。

目前，CMV腸炎診斷包括以下方法：

1.CMV腸炎診斷的金標準是腸鏡下腸黏膜活檢病理檢查，此項有創操作加重了異基因造血干細胞移植術患者的痛苦，取材部位局限，無法重復多次取樣，無法動態觀察病毒拷貝數的變化，并可能帶來腸出血、腸穿孔的風險，極大影響患者的治療與預后。

2.非侵入性方法，例如通過異基因移植術后患者的糞便標本的熒光定量PCR反應檢測CMV核酸被認為是腸道活檢的潛在替代品，有研究表明，基于糞便的PCR檢測在CMV腸炎的診斷或至少排除它方面非常有價值。也有其他研究表明，在糞便中檢測CMV 是CMV腸炎不夠合格的診斷方式。

值得注意的是，DNA提取程序可能對糞便樣本中的CMV檢測產生關鍵影響。

1.首先，糞便標本是一種相當復雜的混合物，其中膽鹽等成分可能通過干預中間許多步驟，包括DNA純化和PCR反應，降低 DNA提取效率和PCR擴增效率來干預許多中間步驟。

2.其次，DNA提取程序決定了產物的主要DNA類型是基因組DNA還是游離DNA，這對于CMV DNA檢測的差異尚未得到充分考慮。

3.最后，常規的核酸定量檢測技術是熒光定量PCR檢測，依賴標準曲線，敏感度有限，容易產生非特異性熒光信號。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組及其微滴式數字PCR試劑盒；本發明基于人巨細胞病毒保守的AD169基因組中編碼即刻早期轉錄調節蛋白的基因(IE1)序列設計特異性引物及MGB水解探針，從而得到微滴式數字PCR試劑盒，本發明通過提取糞便上清游離 DNA和微滴式數字PCR試劑盒檢測糞便中人巨細胞病毒的拷貝數，對輔助臨床診斷患者是否患有CMV腸炎的疾病有重要指導意義。

為實現上述目的，本發明設計一種檢測糞便中人巨細胞病毒的 PCR引物組，所述PCR引物組由引物對CMV-FR和探針CMV-P1 組成，其中，

所述引物對CMV-FR為

上游引物CMV-F1：

5’-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3’，

下游引物CMV-R1：5’-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3’；

所述探針CMV-P1：5’-ATCATGTGTTTAGGCCC-3’，且探針 CMV-P1的5’端標記有熒光基團，其3’端標記有非熒光淬滅基團。

進一步地，所述熒光基團為FAM，所述非熒光淬滅基團為 MGB。

本發明還提供了一種檢測糞便中人巨細胞病毒的微滴式數字 PCR試劑盒，所述PCR試劑盒包括權利要求1所述PCR引物組。