[發明專利]檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組及其微滴式數字PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202210429231.9
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114622040A
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 陳麗婷;周劍峰;顧佳;肖敏;曹陽;黃亮
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 胡鎮西;馮超

1.一種檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組，其特征在于：所述PCR引物組由引物對CMV-FR和探針CMV-P1組成，其中，

所述引物對CMV-FR為

上游引物CMV-F1：

5’-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3’，

下游引物CMV-R1：5’-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3’；

所述探針CMV-P1：5’-ATCATGTGTTTAGGCCC-3’，且探針CMV-P1的5’端標記有熒光基團，其3’端標記有非熒光淬滅基團。

2.根據權利要求1所述檢測糞便中人巨細胞病毒的PCR引物組，其特征在于：所述熒光基團為FAM，所述非熒光淬滅基團為MGB。

3.一種檢測糞便中人巨細胞病毒的微滴式數字PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR試劑盒包括權利要求1所述PCR引物組。

4.根據權利要求3所述微滴式數字PCR試劑盒，其特征在于：所述微滴式數字PCR試劑盒還包括數字PCR緩沖液、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和鋁箔熱封膜。

5.根據權利要求3或4所述的微滴式數字PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR試劑盒還包括內控基因引物組(根據針對編碼人核糖核蛋白復合體亞基基因POP4設計得到)，所述內控基因引物組由內控引物對POP4-FR和內控探針POP4-P，其中，

所述內控引物對POP4為包括

上游引物POP4-F：5’-GGCGGTGGTCCTGGAGTACT-3’，

下游引物POP4-R：5’-AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT-3’；

所述內控探針POP4-P：5’-ACCCGCCACAAGC-3’，且內控探針引物POP4-P的5’端標記有熒光基團。

6.一種權利要求3～5任意一項所述的微滴式數字PCR試劑盒檢測人巨細胞病毒核酸的方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

1)處理糞便標本，提取糞便上清游離DNA；

2)配制微滴式數字PCR反應混合液：將所述微滴式數字PCR檢測試劑和待測樣本DNA模板混合，得到微滴式數字PCR反應混合液；

3)微滴生成：將所述微滴式數字PCR反應混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成儀中生成微滴；

4)PCR擴增反應：將所述生成的微滴轉移到96孔板中，蓋上鋁箔膜，封膜機進行封膜，封完膜將96孔板放入PCR儀進行PCR擴增反應；

5)讀取熒光信號：將擴增后的96孔板置于微滴讀取儀中，設置好參數，利用軟件直接進行結果讀取和分析。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，生成微滴的方法如下：

將微滴式數字PCR反應混合液加入到微滴發生板內，然后在對應的其它孔內加入微滴發生油，再將微滴生成板置入微滴發生卡內，蓋上皮套，放入微滴發生儀中自行進行微滴發生。