[發明專利]鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法

在審

• 申請號: 202210419209.6
• 申請日: 2022-04-21
• 公開（公告）號: CN114854803A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 杜仲坤;趙鼎坤;朱魯生;李冰;王軍;王金花
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12P17/10
• 分類號: C12P17/10;C12P7/42;C12N1/02;C12N1/04;C12N1/14;C12N3/00;B09C1/10;C12R1/77
• 代理公司: 臨沂同其萬疆知識產權代理事務所(普通合伙) 37374
• 代理人: 杜家成

本發明公開了一種鐮刀菌對3,6?二氯咔唑生物降解的方法，該降解方法包括以下步驟：（1）篩選出能夠以3,6?二氯咔唑為唯一碳源生長的菌株；（2）將篩選的的菌株擴大培養，收集擴大培養后的菌體，將菌體接種至滅菌的MSM液體培養基進行培養；（3）篩選出3,6?二氯咔唑高效降解菌株，將降解菌保藏備用；（4）將保藏的降解菌制成孢子懸液；（5）調整含有3,6?二氯咔唑的環境介質的PH值為5.0?9.0，溫度為20℃?40℃，并在孢子懸液中加入碳源，然后將孢子懸液接種至含有3,6?二氯咔唑的環境介質中。本發明從土壤中篩選3,6?二氯咔唑高效降解菌，為3,6?二氯咔唑的降解提供了一種更有效的方法。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體地說，尤其涉及一種鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法。

背景技術

鹵代咔唑是咔唑環上的氫原子被鹵素原子取代的一種化合物。近年來，鹵代咔唑在自然 環境中的檢出率越來越高，才作為一類新型污染物逐漸引起研究者的重視。

鹵代咔唑在環境中分布廣泛，特別是在河流湖泊的沉積物、土壤以及一些生物樣品中能 檢測出較高濃度的鹵代咔唑。基于鹵代咔唑的生物累積性、持久性和類二惡英毒性，亟待尋 找關于鹵代咔唑的降解及污染環境修復的方法。目前已有關于鹵代咔唑光降解及化學氧化分 解等修復方法，但對于修復土壤和沉積物的鹵代咔唑污染有一定的局限性。利用微生物降解 有機物的方法不僅成本低，且對環境產生的二次污染較小，近年來，越來越多的人通過篩選 出能夠以目標污染物為唯一碳源的降解菌，利用降解菌的代謝活動降解污染物。微生物修復 可以作為修復環境中鹵代咔唑污染的有效補充手段，然而目前關于3,6-二氯咔唑這一污染物 的微生物降解方法仍為空白。

發明內容

本發明目的是提供一種鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，該方法是從土壤中篩選 降解菌，并將降解菌投放到含有3,6-二氯咔唑的環境介質中，為3,6-二氯咔唑的降解提供了 一種更有效的方法，該方法對3,6-二氯咔唑的去除效果顯著。

為了實現上述目的，本發明是采用以下技術方案實現的：

一種鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，該降解方法包括以下步驟：

（1）將受3,6-二氯咔唑污染的土壤加入到 MSM 液體培養基中，篩選出能夠以3,6-二氯 咔唑為唯一碳源生長的菌株；

（2）將步驟（1）中篩選的的菌株在LB固體培養基上活化，挑取菌株至已滅菌的LB液體培養基擴大培養，收集擴大培養后的菌體，用已滅菌的MSM液體培養基清洗并重懸若干次， 將最后一次重懸的菌體接種至滅菌的 MSM液體培養基進行培養；

（3）對步驟（2）的MSM液體培養基的菌落取樣，提取并檢測MSM液體培養基中殘留的3,6-二氯咔唑含量，計算各菌株降解率，直至篩選出 3,6-二氯咔唑高效降解菌株，將降解菌 保藏備用；

（4）利用步驟（3）中保藏的降解菌制成孢子懸液；

（5）調整含有3,6-二氯咔唑的環境介質的PH值為5.0-9.0，溫度20℃-40℃，并在上述孢子懸液中加入碳源，然后將孢子懸液接種至含有3,6-二氯咔唑的環境介質中。

進一步的，步驟（1）中菌株富集和純化的方法：在30℃和180 r/min的搖床中培養5d， 5d 后取5.00 mL富集培養液的上清液轉接至新的含100.00 mg/L 3,6-二氯咔唑的MSM液體培養基中，重復操作3次，取最后一次富集的培養液1.00 mL加入滅菌的去離子水中，按照10-1、10-2、10-3的比例進行逐級梯度稀釋，吸取稀釋后的培養液50.00μL涂布于含3,6-二氯咔唑100.00mg/L 的MSM固體培養基中，將其倒置于30℃培養箱中培養；待菌落形成后，用滅菌牙簽挑取不同形態的單菌落在LB固體培養基中劃線，經過反復的挑選分離，直至分離出純菌。