[發明專利]鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法

在審

• 申請號: 202210419209.6
• 申請日: 2022-04-21
• 公開（公告）號: CN114854803A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 杜仲坤;趙鼎坤;朱魯生;李冰;王軍;王金花
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12P17/10
• 分類號: C12P17/10;C12P7/42;C12N1/02;C12N1/04;C12N1/14;C12N3/00;B09C1/10;C12R1/77
• 代理公司: 臨沂同其萬疆知識產權代理事務所(普通合伙) 37374
• 代理人: 杜家成

1.一種鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：該降解方法包括以下步驟：

（1）將受 3,6-二氯咔唑污染的土壤加入到 MSM 液體培養基中，通過富集和純化篩選出 能夠以 3,6-二氯咔唑為唯一碳源生長的菌株；

（2）將步驟（1）中篩選的的菌株在 LB 固體培養基上活化，挑取菌株至已滅菌的 LB 液體培養基擴大培養，收集擴大培養后的菌體，用已滅菌的 MSM 液體培養基清洗并重懸若干次， 將最后一次重懸的菌體接種至滅菌的 MSM 液體培養基進行培養；

（3）對步驟（2）中 MSM 液體培養基的菌落取樣，提取并檢測 MSM 液體培養基中殘留的3,6-二氯咔唑含量，計算各菌株降解率，直至篩選出 3,6-二氯咔唑高效降解菌株，將降解菌 保藏備用；

（4）利用步驟（3）中保藏的降解菌制成孢子懸液；

（5）調整含有 3,6-二氯咔唑的環境介質的 PH 值為 5.0-9.0，溫度為 20℃-40℃，并在 上述孢子懸液中加入碳源，然后將孢子懸液接種至含有 3,6-二氯咔唑的環境介質中。

2.根據權利要求 1 所述的鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步驟（1）中菌株富集和純化的方法：在 30℃和 180 r/min 的搖床中培養 5 d，5 d 后取 5.00mL 富集培養液的上清液轉接至新的含 100.00 mg/L 3,6-二氯咔唑的 MSM 液體培養基中，重復操 作 3 次，取最后一次富集的培養液 1.00 mL 加入滅菌的去離子水中，按照10-1、10-2、10-3的 比例進行逐級梯度稀釋，吸取稀釋后的培養液 50.00 μL 涂布于含 3,6-二氯咔唑 100.00 mg/L 的 MSM 固體培養基中，將其倒置于 30℃培養箱中培養；待菌落形成后，用滅菌牙簽挑取不同 形態的單菌落在 LB 固體培養基中劃線，經過反復的挑選分離，直至分離出純菌。

3.根據權利要求 2 所述的鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于： 所述 MSM 液體培養基的制作方法：以 1000 mL 去離子水計，稱取硫酸銨 1.00 g、氯化鈉1.00 g、磷酸氫二甲 1.50 g、磷酸二氫鉀 0.50 g、硫酸鎂 0.20 g，加入 1000 mL 去離子水 溶解，再加入 1.00 mL 微量元素溶液，用氫氧化鈉調節 pH 至 7.0 左右，121℃高溫高壓滅菌 30 min；

所述 MSM 固體培養基的制作方法：在 MSM 液體培養基基礎上添加瓊脂粉制成；

所述微量元素溶液的制備方法：以 1000 mL 去離子水計，稱取鉬酸鈉 0.15 g、一水硫酸 錳 0.13 g、結晶氯化鋁 0.05 g、氯化鋅 0.23 g、一水硫酸銅 0.03 g、六水合氯化鈷0.42 g，加 1000 mL 去離子水溶解，用氫氧化鈉或鹽酸調節 pH 至 7.0 左右。

4. 根據權利要求 1 所述的鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于： 所述 LB 液體培養基的制作方法：以 1000 mL 去離子水計，向氯化鈉 10.00 g、酵母浸膏5.00 g、蛋白胨 10.00 g，加 1000 mL 去離子水溶解，用氫氧化鈉調節 pH 至 7.0 左右，121 ℃高溫高壓滅菌 30 min； 所述 LB 固體培養基的制作方法：在 LB 液體培養基基礎上添加瓊脂粉制成。

5. 根據權利要求 1 所述的鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步驟 （2）中， LB 液體培養基擴大培養的條件：在 30℃，180 r/min 的條件下擴大培養 3 d；收集擴大培養后的菌體的方法：在 20℃，5000 r/min 條件離心 5 min 收集菌體。

6.根據權利要求 1 所述的鐮刀菌對3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步驟（2）中，MSM 液體培養基培養的條件：調整菌液濃度為 OD600 = 1.0 左右，使培養基中 3,6- 二氯咔唑濃度為 10.00 mg/L，在 30℃，180 r/min 的條件下培養 8 d。