[發(fā)明專利]用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的添加劑及其培養(yǎng)基和用途在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202210418768.5 | 申請(qǐng)日： | 2022-04-20 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN114854690A | 公開(kāi)（公告）日： | 2022-08-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 武瑞琴;王正遠(yuǎn);楊海 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 南寧云冪方生物醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N5/09 | 分類號(hào)： | C12N5/09;C12N5/071;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138 | 代理人： | 邢少真 |
| 地址： | 530007 廣西壯族自治區(qū)*** | 國(guó)省代碼： | 廣西;45 |
| 權(quán)利要求書(shū)： | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū)： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 癌細(xì)胞 培養(yǎng) 添加劑 及其 培養(yǎng)基 用途 | ||
1.一種用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的添加劑，其特征在于，包括霍亂毒素、R-spondin、A-83-01和Y-27632中的至少三種；優(yōu)選地為霍亂毒素、R-spondin、Y-27632。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的添加劑，其特征在于，包括霍亂毒素、R-spondin、A-83-01和Y-27632。
3.一種用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的添加劑，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包含完全DMEM培養(yǎng)基和F12營(yíng)養(yǎng)混合物，更優(yōu)選地，所述添加劑包含于所述F12營(yíng)養(yǎng)混合物中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述F12營(yíng)養(yǎng)混合物還包括氫化可的松、EGF、胰島素、兩性霉素B、慶大霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述完全DMEM培養(yǎng)基含或者不含有5-10％血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述完全DMEM培養(yǎng)基和所述F12營(yíng)養(yǎng)混合物的體積比為(2-4)：1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基不含有成纖維細(xì)胞。
8.一種如權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基在腫瘤藥物敏感性篩選中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，具體方法如下：
S1.分離腫瘤組織：
S101.將切除組織標(biāo)本用乙醇溶液快速?zèng)_洗，再用2-5℃PBS溶液沖洗，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中；
S102.去除殘余脂肪組織；
S103.將新鮮標(biāo)本切成直徑小于10mm的小塊，得到組織碎片；
S2.原代細(xì)胞培養(yǎng)：
S201.用F培養(yǎng)基稀釋10倍濃度膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液，并將溶液置于管中；
S202.將F培養(yǎng)基/膠原酶/透明質(zhì)酸酶與分散酶混合；
S203.將步驟S103得到的組織碎片轉(zhuǎn)移到含有F培養(yǎng)基/膠原酶/透明質(zhì)酸酶/分散酶的管中，并在35-40℃下在搖擺平臺(tái)上孵育1-3h；
S204.消化完后，將細(xì)胞離心并棄去上清液；
S205.將細(xì)胞沉淀重懸于權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述完全DMEM/F12培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸液通過(guò)100μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾到新的離心管中，將細(xì)胞離心并棄去上清液；
S3.藥物敏感性測(cè)試：
S301.將步驟S205培養(yǎng)好的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，稀釋，接種至96孔板，每個(gè)孔細(xì)胞總數(shù)為2000-3000個(gè)；
S302.經(jīng)過(guò)10-15h貼壁培養(yǎng)，將待測(cè)藥物的DMSO溶液加入對(duì)應(yīng)的孔中，每個(gè)藥物的給藥的最高給藥濃度為50Um，往下10倍比稀釋5個(gè)濃度，得到6個(gè)給藥濃度；
S303.給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，用熒光法測(cè)定細(xì)胞活力，計(jì)算每個(gè)藥物的IC50值，
任選地，所述乙醇溶液快速?zèng)_洗的時(shí)間不超過(guò)3s；所述乙醇溶液濃度為95-100％。
10.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的添加劑在制備用于癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的用途。
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