[發(fā)明專利]原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法及專用培養(yǎng)基

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210412486.4
• 申請(qǐng)日: 2022-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN114774360A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文斌;鄭曉紅;陳峰;王燦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N5/079
• 代理公司: 北京思元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發(fā)明公開了原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法及專用培養(yǎng)基。所述專用培養(yǎng)基的成分包括：DMEM/F12，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，N2添加劑，B27添加劑，2?巰基乙醇，人胰島素，谷氨酰胺，丙酮酸鈉，最低基本培養(yǎng)基，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和青霉素?鏈霉素。本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用該專用培養(yǎng)基獲得PCNSL原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法。采用本發(fā)明的PCNSL原代細(xì)胞的專用培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法能夠得到PCNSL的原代細(xì)胞，可用于PCNSL發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究和抗腫瘤藥物篩選，同時(shí)為后續(xù)培養(yǎng)PCNSL細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法及專用培養(yǎng)基，屬于原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)是一種罕見且具有侵襲性的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤，其發(fā)病率占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的4％，占結(jié)外淋巴瘤的4％-6％。PCNSL病程短，進(jìn)展快，預(yù)后差，具有高度致死性，5年和10年生存率分別為37.6％和29.7％。PCNSL的最佳治療方案尚未確定，基于高劑量甲氨蝶呤的聯(lián)合治療是目前PCNSL的一線治療方案。盡管一線治療有較高的緩解率，但仍有50％患者會(huì)復(fù)發(fā)，10-15％的患者為原發(fā)耐藥，屬結(jié)外淋巴瘤中預(yù)后很差的類型，因此臨床亟需新的治療藥物優(yōu)化一線治療方案。通過體外培養(yǎng)病人來源的PCNSL細(xì)胞，構(gòu)建PCNSL疾病模型進(jìn)行臨床前藥物篩選迫在眉睫。

鑒于PCNSL是一種罕見腫瘤，目前仍然沒有原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的相關(guān)報(bào)道且無成熟的細(xì)胞系，體外PCNSL發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究以及抗腫瘤藥物篩選均受到了很大限制。早期PCNSL的基礎(chǔ)研究是基于體部非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的異種移植模型，并不能真實(shí)還原PCNSL發(fā)生發(fā)展的歷程。隨著病人來源的異種移植模型(PDX)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，近年來PCNSL的基礎(chǔ)研究是基于病人來源的PCNSL異種移植模型。雖然PDX技術(shù)能很好的應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選，但構(gòu)建PDX模型周期長(zhǎng)，成本高，成功率低。同時(shí)，基于手術(shù)切除對(duì)PCNSL患者無明顯生存獲益且存在神經(jīng)損傷后遺癥，針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南不推薦手術(shù)切除，導(dǎo)致PCNSL大塊組織難以獲得，PDX模型構(gòu)建更加困難。因此，亟需一種容易構(gòu)建PCNSL疾病模型的方法。

通過特制的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)病人來源的PCNSL組織，獲得PCNSL原代細(xì)胞，建立體外PCNSL疾病模型，可以從細(xì)胞分子角度去深入研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并且可以有針對(duì)性的利用此類細(xì)胞進(jìn)行臨床前藥物篩選及藥效評(píng)估。相比于PDX模型，該培養(yǎng)方法培養(yǎng)周期更短，成本更低，技術(shù)上更容易實(shí)施和普及。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供用于原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的專用培養(yǎng)基；

本發(fā)明的目的之二是提供原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明一方面提供了用于原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細(xì)胞的專用培養(yǎng)基(PCNSL培養(yǎng)基)，所述專用培養(yǎng)基的成分包括：DMEM/F12，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasalmedium)，N2添加劑(N2 supplement)，B27添加劑(B27 supplement)，2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)，人胰島素(Human insulin)，谷氨酰胺(Glutamax)，丙酮酸鈉(Sodiumpyruvate)，最低基本培養(yǎng)基(MEM)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin)。

優(yōu)選的，每50ml的專用培養(yǎng)基中，各成分的體積或其終濃度為：

2-Mercaptoethanol其終濃度為3.5ul/L；