[發(fā)明專利]原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞的培養(yǎng)方法及專用培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210412486.4
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114774360A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設計）人: 李文斌;鄭曉紅;陳峰;王燦
• 申請（專利權）人: 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/079
• 代理公司: 北京思元知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.用于原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞的專用培養(yǎng)基，其特征在于，所述專用培養(yǎng)基的成分包括：DMEM/F12，神經(jīng)基礎培養(yǎng)基，N2添加劑，B27添加劑，2-巰基乙醇，人胰島素，谷氨酰胺，丙酮酸鈉，最低基本培養(yǎng)基，表皮細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子，青霉素-鏈霉素。

2.根據(jù)權利要求1所述的專用培養(yǎng)基，其特征在于，每50ml的專用培養(yǎng)基中，各成分的體積或終濃度為：

DMEM/F12 25ml；

神經(jīng)基礎培養(yǎng)基 25ml；

N2添加劑 250ul；

B27添加劑 500ul；

2-巰基乙醇 終濃度為3.5ul/L；

人胰島素 終濃度為2.5ug/ml；

谷氨酰胺 500ul；

丙酮酸鈉 500ul；

最低基本培養(yǎng)基 250ul；

表皮細胞生長因子 終濃度為20ng/ml；

堿性成纖維細胞生長因子 終濃度為20ng/ml；

青霉素-鏈霉素 500ul。

3.原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括：

(1)將新鮮的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織置于DMEM/F12培養(yǎng)基中無菌環(huán)境下剪切至1mm³～2mm³組織塊；

(2)將步驟(1)得到的組織塊懸浮后離心，棄上清，加入權利要求1所述的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞的專用培養(yǎng)基以及matrigel混勻得到混懸液，向凹陷性小窩中迅速加入20ul混懸液；將裝有混懸液的凹陷性小窩置于培養(yǎng)皿中并加入PBS保濕，再放入CO₂培養(yǎng)箱中至matrigel固化；

(3)將固化的matrigel包埋的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織塊從凹陷性小窩中完整剝離置于12孔板中，每孔加入原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤培養(yǎng)基進行原代細胞培養(yǎng)直至有原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞從matrigel包埋的小球中溢出。

4.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中將新鮮的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織置于DMEM/F12培養(yǎng)基中無菌環(huán)境下剪切至1mm³～2mm³的組織塊。

5.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的凹陷性小窩的制備方法包括：用封口膜在10ul移液槍槍頭盒板上制作12～16個能容納20ul以上的培養(yǎng)體的凹陷性小窩。

6.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤培養(yǎng)基和matrigel按照1:4～1:9的體積比例添加。

7.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中將裝有混懸液的凹陷性小窩置于6cm培養(yǎng)皿中并加入1～2mlPBS保濕，再放入37℃，5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中至matrigel固化。

8.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中將固化的包埋有原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織塊的培養(yǎng)基從凹陷性小窩完整剝離置于12孔板中，3-4個/孔，每孔加入2ml權利要求1所述的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

9.根據(jù)權利要求3或8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中每孔加入原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤培養(yǎng)基進行原代細胞培養(yǎng)時每3～4天進行半換液。

10.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中從matrigel包埋的小球中溢出的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤原代細胞呈圓形，聚團懸浮生長。