[發(fā)明專利]一種利用生物膜干涉技術快速檢測金黃色葡萄球菌的方法

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• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114791491A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設計）人: 張曉光;李爽;宋慧妍;于婉婷;張艷;路琪;劉子婕;郝瑩;白瑪措姆
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 李榮武

本發(fā)明公開了一種利用生物膜干涉技術快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，該方法為：步驟一、傳感器平衡；步驟二、傳感器活化；步驟三、抗體固定化；步驟四、一次封閉；步驟五、二次封閉；步驟六、樣品檢測及結果分析。本發(fā)明的有益效果：步驟少，無標記，實時監(jiān)測，簡便快捷，結果判斷簡單；操作簡單易學，僅需要向樣品板中添加配置好的試劑及制備好的樣品即可上機檢測，實時讀取結合信號即可判斷金黃色葡萄球菌的存在；醋酸?醋酸鈉緩沖溶液稀釋后的抗體可回收后重復使用，降低檢測成本；檢測高通量，配合相應的生物分子相互作用儀及配套使用的樣品板，可實現多達95個樣品的同時檢測；具有較好的特異性，可排除樣品中非目標菌的干擾。

技術領域

本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，特別涉及一種抗體結合生物膜干涉技術的金黃色葡萄球菌快速檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌是廣泛存在于自然界和人體皮膚上的兼性厭氧革蘭氏陽性菌，是皮膚化膿感染常見的病原菌，其產生的腸毒素會導致中毒。食品易受其污染，導致人體食物中毒，主要癥狀是發(fā)燒、腹瀉和惡心嘔吐。金黃色葡萄球菌分泌20多種毒性蛋白質，常見的有7種，可耐高溫，100℃加熱30min不被破壞。據報道成人僅食用約100ng腸毒素A，即可導致食物中毒。近幾年，我國因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居全世界第4位。目前，傳統的金黃色葡萄球菌檢測方法具有靈敏度高、成本低的優(yōu)點，但選擇性前增菌、選擇性平板培養(yǎng)、染色鏡檢和血漿凝固酶鑒定等步驟復雜，耗時長，不能滿足快速檢測的需要。免疫學檢測方法(如酶聯免疫技術)檢測時間明顯縮短，但對試劑的選擇性高。因此，為減少相關食源性疾病的發(fā)生，快速便捷、靈敏準確且易于操作的金黃色葡萄球菌的新型檢測方法亟需開發(fā)。

生物膜干涉(biolayer interferometry，BLI)技術是通過實時監(jiān)測光干涉信號的變化來實現生物分子的相互作用分析或檢測。該技術所使用的Octet是多通道檢測設備，整個檢測過程完全自動化，能夠控制檢測模塊的溫度，并且檢測后樣品可回收。該技術具有高靈敏度、無微流控系統、免標記、快速、簡便、可實時提供檢測結果等優(yōu)點，非常適合于對食源性致病菌進行快速、靈敏的檢測。

抗體是生物傳感器中應用范圍最廣的識別元件，根據其制備方法和原理，可分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。使用抗體進行抗原識別被稱為免疫測定法，它被用于各種生物傳感器形式。但以抗體作為BLI生物傳感器的生物識別元件并將該技術應用于食源性致病菌的快速檢測卻鮮有報道。

本發(fā)明以抗體作為第二代氨基偶聯傳感器的生物識別元件對金黃色葡萄球菌進行識別檢測。第二代氨基偶聯傳感器增加了結合密度，固化條件也更為穩(wěn)定，同時大幅降低了非特異性結合。傳感器表面適用于各種pH和鹽條件，為更高通量應用的再生條件開發(fā)提供了堅固性和靈活性。第二代氨基偶聯傳感器表面修飾有羧基基團，抗體固定時，傳感器表面的羧基基團先在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合的活化試劑中活化后形成NHS酯；NHS酯可與抗體上的氨基基團反應形成極其穩(wěn)定的酰胺鍵從而把抗體固定在第二代氨基偶聯傳感器表面。若樣品中存在金黃色葡萄球菌，則菌體會被固定在表面的抗體特異性識別并結合，使傳感器光學層厚度增加，干涉光譜產生位移，產生的響應信號被光譜儀實時檢測記錄從而實現金黃色葡萄球菌的實時無標記快速檢測。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為解決傳統檢測金黃色葡萄球菌方法中步驟多、操作繁瑣等問題而提供的一種基于生物膜干涉技術的金黃色葡萄球菌快速檢測方法。

本發(fā)明提出了一種抗體結合生物膜干涉技術的金黃色葡萄球菌快速檢測方法。該方法包括傳感器平衡、傳感器活化、抗體固定化、一次封閉、二次封閉、樣品檢測及結果分析，其具體步驟如下：

步驟一、傳感器平衡：先將第二代氨基偶聯傳感器末端浸入純水中預濕至少10分鐘，以平衡傳感器；

步驟二、傳感器活化：將平衡后的第二代氨基偶聯傳感器浸入20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10mM N-羥基琥珀酰亞胺混合試劑中活化300-450秒；