[發(fā)明專利]一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210411872.1
• 申請(qǐng)日: 2022-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN114774455A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭維;唐婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

本發(fā)明公開了一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建尿嘧啶生物合成相關(guān)基因被破壞的突變擬輪枝鐮孢菌，為擬輪枝鐮孢菌中尿嘧啶生物合成相關(guān)基因功能的研究奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)破壞擬輪枝鐮孢菌中的尿嘧啶生物合成相關(guān)基因，建立了一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9基因編輯體系，從而促進(jìn)擬輪枝鐮孢菌的基因功能研究，為發(fā)掘更多具有生物學(xué)功能的基因奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

擬輪枝鐮孢菌是一類全球范圍發(fā)生的植物病原真菌，不僅能夠通過(guò)病原菌侵染造成玉米減產(chǎn)，而且能夠產(chǎn)生多種真菌毒素，污染農(nóng)作物以及農(nóng)副產(chǎn)品，對(duì)人畜的健康造成影響。因此對(duì)其功能基因組進(jìn)行研究以尋找藥物靶標(biāo)來(lái)開發(fā)相關(guān)農(nóng)藥具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。目前擬輪枝鐮孢菌的功能基因組研究受到研究方法效率低以及抗性篩選標(biāo)記數(shù)量少的限制，進(jìn)展相對(duì)緩慢，因此發(fā)展新的基因編輯技術(shù)對(duì)擬輪枝鐮孢菌的基礎(chǔ)研究、代謝工程以及合成生物學(xué)研究等具有重要意義。

尿嘧啶生物合成相關(guān)基因可作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記應(yīng)用于絲狀真菌的基因功能研究。pyrG基因編碼的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶和pyrE基因編碼的乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在尿嘧啶的從頭合成途徑中起著重要作用，任何一個(gè)基因缺失所產(chǎn)生的尿嘧啶缺陷型菌株都不能正常合成生長(zhǎng)所必須的尿嘧啶，必須在外源補(bǔ)充尿嘧啶的情況下才能夠生長(zhǎng)，同時(shí)該突變體還可以被5-氟乳清酸(5-FOA)反向篩選。5-FOA篩選的機(jī)制如下：5-FOA可以作為乳清酸類似物進(jìn)入尿嘧啶從頭合成路徑，最終產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的5-氟尿嘧啶，因此野生型菌株的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株因缺少尿嘧啶合成途徑，無(wú)法將5-FOA轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，因此可以生長(zhǎng)。這些特性使得pyrG和pyrE基因具有開發(fā)成為抗性篩選標(biāo)記基因的潛力。對(duì)擬輪枝鐮孢菌中的尿嘧啶生物合成相關(guān)基因進(jìn)行研究能夠促進(jìn)該類病菌中傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的發(fā)掘。

CRISPR/Cas9是近年來(lái)快速發(fā)展的一種基因編輯技術(shù)，主要包含兩部分：具有DNA雙鏈剪切功能的Cas9蛋白和能夠識(shí)別靶標(biāo)位點(diǎn)的sgRNA。其中sgRNA由能夠與靶標(biāo)DNA序列結(jié)合的crRNA以及能夠與Cas9蛋白結(jié)合的tracRNA組成，crRNA通過(guò)tracRNA將Cas9蛋白引導(dǎo)至靶標(biāo)基因處對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，結(jié)合生物體自身的DNA修復(fù)機(jī)制，人為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的破壞、敲除、敲入以及單堿基編輯等目的。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有原理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、敲除效率高以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在動(dòng)物、植物、細(xì)菌以及真菌等生物體中得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，解決了目前擬輪枝鐮孢菌基因組功能研究方法效率低以及抗性篩選標(biāo)記數(shù)量少的問(wèn)題，加快了研究進(jìn)展，對(duì)擬輪枝鐮孢菌的基礎(chǔ)研究、代謝工程以及合成生物學(xué)研究等具有重要意義。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，具有如下技術(shù)方案：

一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S1.根據(jù)尿嘧啶生物合成相關(guān)基因pyrG和pyrE的外顯子序列，分別選取核酸序列為如SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2所示的靶標(biāo)位點(diǎn)locus505和locus86；