[發明專利]一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210411872.1
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114774455A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 郭維;唐婷婷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

1.一種適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.根據尿嘧啶生物合成相關基因pyrG和pyrE的外顯子序列，分別選取核酸序列為如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的靶標位點locus505和locus86；

S2.以pFC334載體為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4所示的引物對進行PCR，分別擴增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的片段；以pFC334載體為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4所示的引物對進行PCR，擴增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的片段；分別以核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的片段為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對進行融合PCR，擴增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的sgRNA表達框；

S3.以限制性內切酶PacI單酶切pFC332載體，利用一步克隆法將S2步驟所得的sgRNA表達框片段分別連接至pFC332載體上，連接產物轉化至TG-1大腸桿菌感受態細胞中，經氨芐霉素抗性篩選、菌落PCR篩選以及測序驗證后，得到適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體。

2.一種根據權利要求1所述的構建方法構建得到的適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體。

3.如權利要求2所述的適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體在擬輪枝鐮孢菌尿嘧啶生物合成基因研究中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

將如權利要求2所述的適用于擬輪枝鐮孢菌的CRISPR/Cas9載體通過聚乙二醇介導的原生質體轉化方法導入擬輪枝鐮孢菌的原生質體內，先用潮霉素抗性平板篩選后，再用5-氟乳清酸抗性平板篩選，挑取轉化子擴大培養后提取基因組，測序后與野生型菌株的序列比對，分析靶標基因的突變位點，結合觀察突變體的表型，驗證尿嘧啶生物合成相關基因的功能。