[發(fā)明專利]檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210410105.9
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114778727A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王天一;李艷杰;周傳貴;李艷;胡瑋;程文播;周玉松;覃素姿;楚士穎;張怡銘;韓竑宣;朱思宇
• 申請（專利權(quán)）人: 天津國科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司;蘇州國科醫(yī)工科技發(fā)展（集團(tuán)）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 楊明霞

1.一種檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣本前處理：

1-1)取凍存母乳樣本解凍，加入內(nèi)標(biāo)沉淀劑，渦旋震蕩；

1-2)加入正己烷，然后加入飽和氯化鈉溶液抑制乳化，渦旋混勻；

1-3)離心，取上清液，40℃氮?dú)庀麓蹈桑偈褂脧?fù)溶液復(fù)溶，渦旋震蕩；

1-4)離心，濾膜過濾，留上清液，得到測試樣；

2)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對測試樣進(jìn)行脂溶性維生素的定量檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到凍存母乳樣本中的脂溶性維生素的含量；

其中，所述脂溶性維生素至少包括維生素A、25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、維生素E中的一種或多種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，所述步驟1)具體包括：

1-1)取凍存母乳樣本解凍，加入內(nèi)標(biāo)沉淀劑，渦旋震蕩30-120s；

1-2)加入正己烷，然后加入飽和氯化鈉溶液抑制乳化，1250-5000轉(zhuǎn)/分下渦旋混勻2-10min；

1-3)于4℃、7000-28000轉(zhuǎn)/分離心5-20min，取上清液，40℃氮?dú)庀麓蹈桑偈褂脧?fù)溶液復(fù)溶，渦旋震蕩2-10min；

1-4)于4℃、7000-28000轉(zhuǎn)/分離心5-20min，用0.22μm的濾膜過濾，留上清液，得到測試樣。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，所述步驟1)具體包括：

1-1)取凍存母乳樣本解凍，取1mL母乳樣本向其中加入2mL內(nèi)標(biāo)沉淀劑，渦旋震蕩60s；

1-2)加入5mL正己烷，然后加入2mL飽和氯化鈉溶液抑制乳化，2500轉(zhuǎn)/分下渦旋混勻5min；

1-3)于4℃、14000轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清液4mL，40℃氮?dú)庀麓蹈桑偈褂?mL復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋震蕩5min；

1-4)于4℃、14000轉(zhuǎn)/分離心10min，用0.22μm的濾膜過濾，留上清液，取上清液100μL作為測試樣。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，所述內(nèi)標(biāo)沉淀劑為甲醇和乙腈的混合液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，所述內(nèi)標(biāo)沉淀劑中甲醇和乙腈的體積比為1：1。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，所述復(fù)溶液為甲醇和水的混合液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，所述復(fù)溶液中甲醇和水的體積比為1：1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，所述步驟2)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法為：

2-1)制備一系列濃度的脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)液；

2-2)按照步驟1)的方法對脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行處理，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測，得到脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，液相色譜條件為：

色譜柱：Phenomenex的Kinetex C18柱；

流動相：A相為甲酸水溶液，B相為甲酸甲醇溶液；

梯度洗脫程序：0-0.5min，80％B；0.5-1.5min，100％B；1.5-3.5min，100％B；3.5-3.6min，80％B；3.6-5.0min，80％B；

流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測凍存母乳中脂溶性維生素的方法，其特征在于，其中，質(zhì)譜條件為：

離子源：ESI源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣25psi，噴霧器60psi，NC：5，溫度350℃，碰撞氣4psi。