[發明專利]一種PSGL-1人源化非人類動物模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 202210409835.7
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114747541B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 楊志偉;吳獻賢;劉星;王智慧
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;A01K67/027;C12N15/113;C12N15/85;C12N15/89;A61K49/00
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 高倩倩

本發明公開了一種PSGL?1人源化非人類動物模型的構建方法及應用。本發明利用CRISPR/Cas9技術，在非人類動物的Rosa26loci位點定點敲入人PSGL?1基因，構建可以表達人源PSGL?1的非人類動物模型。通過相關實驗，分別在核酸水平和蛋白水平上說明本發明成功構建了人源化PSGL?1非人類動物模型。利用該非人類動物模型可進行人PSGL?1蛋白在炎癥相關疾病發病過程中的研究，并實現人源化PSGL?1抗體藥物的安全性和有效性評價。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體而言，本發明涉及一種PSGL-1人源化非人 類動物模型的構建方法及應用。

背景技術

白細胞束縛和滾動是炎癥反應發生的起始步驟，體內發炎血管的束縛和滾 動主要是由選擇素(selectin)介導的。而P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1) 是一種持續表達在所有白細胞(包括單核細胞，粒細胞，淋巴細胞某些CD34+ 干細胞)表面的，能夠和選擇素結合的二聚體型，粘蛋白型糖蛋白配體。選擇 素有三個亞型，包括P-selectin,E-selectin和L-selectin,其中P-selectin表達于激 活的血小板和血管內皮細胞表面，E-selectin表達于激活的內皮細胞表面，L- selectin表達于大部分白細胞表面。PSGL-1能與三種選擇素結合，但是與P- selectin結合能力最強。PSGL-1與激活的血管內皮表面P-selectin/E-selectin結合 之后啟動白細胞與血管內皮的粘附和滾動，促進白細胞向內膜下的浸潤，促進 炎癥因子的分泌；PSGL-1與活化的血小板表面的P-selectin結合，導致白細胞- 血小板復合體的形成，進一步促進炎癥細胞的粘附和浸潤；PSGL-1與T細胞表 面的L-selectin的結合能調節T細胞的歸巢，促進后續炎癥因子的分泌。

人PSGL-1蛋白的結構包括結合區，跨膜區和胞質區(PSGL-1 as a noveltherapeutic target.Constantin G.Drug News Perspect 2004)。粘蛋白在其上形成二硫鍵結合的同二聚體。人PSGL-1富含絲氨酸，蘇氨酸和脯氨酸，并包含15個 十聚體重復序列。殘基46、48和51的三個NH₂末端酪氨酸位于有利于酪氨酸 硫酸化的陰離子共有序列中。潛在的O-連接的糖基化位點存在于蘇氨酸44、57、 69和70中。P-選擇素通過與聚簇的酪氨酸硫酸鹽和附近的核心2O-聚糖與唾液 酸化的Lewis x(sLex)表位立體定向相互作用，與PSGL-1的N末端結合。類 似地，L-選擇蛋白通過與三個硫酸化酪氨酸殘基和適當定位的C2-O-sLex O-聚 糖的協同相互作用，以高親和力與PSGL-1的N末端區域結合。E-選擇蛋白-PSGL-1的結合似乎不依賴于硫酸鹽化，需要巖藻糖基轉移酶使sLex和PSGL-1 糖基化。越來越多的研究表明，PSGL-1和炎癥性疾病的發生發展密切相關，如 胰腺炎、結腸炎、缺血再灌注損傷、血栓、動脈粥樣硬化等。PSGL-1在炎癥相 關疾病中發揮重要作用。

目前已經研發出多個針對人PSGL-1基因靶點的抗體，如Neihulizumab和 SelK-2。然而，由于人PSGL-1基因與動物PSGL-1基因同源性低，存在較大的 差異。這些針對人PSGL-1基因靶點的抗體或者藥物并不能識別動物PSGL-1基 因靶點，導致無法用普通野生型動物評價這類抗體的有效性及安全性。故需對 野生型動物的PSGL-1基因進行人源化改造，使其含有人PSGL-1基因，并表達 人PSGL-1蛋白，用于評價抗體或藥物的體內有效性及安全性。

發明內容

大多數關于PSGL-1的研究都是基于PSGL-1敲除的非人類動物模型，尚未 見人源化PSGL-1非人類動物模型報道。本發明的目的是提供一種hPSGL-1人 源化非人類動物模型及其構建方法，利用該人源化非人類動物模型可進行人 PSGL-1蛋白在炎癥相關疾病發病過程中的研究，并實現人源化PSGL-1抗體藥 物的安全性和有效性評價。本發明提供了一種敲入人PSGL-1基因的方式，構建 可以表達人源PSGL-1的非人類動物模型，對實現其它人源基因的定點敲入亦有 參考價值。