[發明專利]一種豬鏈球菌高效轉座突變系統及其應用

在審

• 申請號: 202210408450.9
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114717253A
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 黃琦;張詠晴;周銳;邱德新;黎璐
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/65;C12N15/54;C12N1/21;C40B50/06;C12R1/46
• 代理公司: 深圳峰誠志合知識產權代理有限公司 44525
• 代理人: 張騰

1.一種Mariner轉座酶表達盒，其特征在于，包括一個gapdh基因啟動子和Mariner轉座酶的編碼序列，其在豬鏈球菌中表達Mariner轉座酶，所述gapdh基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述轉座酶基因Mariner的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

2.一種豬鏈球菌高效轉座突變系統，包含由權利要求1所述的Mariner轉座酶表達盒、抗性表達盒組成的基因片段Tn，以及質粒，所述抗性表達盒由抗性基因及兩側的轉座酶識別序列組成，兩側的所述轉座酶識別序列分別如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，抗性表達盒可被Mariner轉座酶識別后將該抗性表達盒插入至豬鏈球菌染色體的TA堿基位點。

3.根據權利要求2所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統，其特征在于，所述抗性表達盒為紅霉素抗性表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

4.根據權利要求3所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統，其特征在于，所述基因片段Tn的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根據權利要求4所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統，其特征在于，所述質粒為pSET4s質粒，所述基因片段Tn插入pSET4s質粒中形成所述豬鏈球菌高效轉座突變系統，即pSET4s-Tn質粒。

6.根據權利要求5所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統，其特征在于，所述pSET4s質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有如下基因片段：豬鏈球菌溫敏復制元件Ts ori、大腸桿菌復制元件ColE1 ori、壯觀霉素抗性表達盒。

7.根據權利要求6所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統，其特征在于，所述豬鏈球菌高效轉座突變系統的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.如利用權利要求5～7任一項所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統的構建方法，其特征在于，其步驟如下：將所述pSET4s質粒用限制性內切酶BglII+HindIII雙酶切后用DNA回收試劑盒回收大片段，人工合成所述基因片段Tn，在37℃的條件下利用同源重組酶將酶切后的pSET4s質粒與Tn片段連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態，37℃過夜培養，挑選陽性克隆過夜培養。

9.如權利要求2～7任一項所述的豬鏈球菌高效轉座突變系統的在豬鏈球菌轉座子突變庫構建中的應用。