[發(fā)明專利]一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210408450.9
• 申請(qǐng)日: 2022-04-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114717253A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃琦;張?jiān)伹?/a>;周銳;邱德新;黎璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12N15/65;C12N15/54;C12N1/21;C40B50/06;C12R1/46
• 代理公司: 深圳峰誠(chéng)志合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44525
• 代理人: 張騰

本發(fā)明公開(kāi)了一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)，所述轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)，即pSET4s?Tn質(zhì)粒，包括：(一)豬鏈球菌溫敏復(fù)制元件Ts ori；(二)大腸桿菌復(fù)制元件ColE1ori；(三)Mariner轉(zhuǎn)座酶表達(dá)盒；(四)壯觀霉素抗性表達(dá)盒(Spc^R)；(五)上游和下游均包含一個(gè)轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列(IR)的紅霉素抗性表達(dá)盒(Erm^R)。利用該轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)在豬鏈球菌中的高效轉(zhuǎn)座突變，在單次實(shí)驗(yàn)中能夠達(dá)到98％以上的豬鏈球菌為轉(zhuǎn)座突變體，轉(zhuǎn)座子插入在豬鏈球菌基因組中TA堿基位點(diǎn)，且轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)無(wú)明顯偏好性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病原細(xì)菌，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也可感染人導(dǎo)致中毒休克樣綜合征，死亡率較高，危害公共衛(wèi)生安全。開(kāi)展豬鏈球菌的病原生物學(xué)和功能基因組學(xué)研究對(duì)鑒定新型抗菌藥物靶點(diǎn)以及發(fā)現(xiàn)疫苗候選抗原具有重要意義。

對(duì)病原菌進(jìn)行高效、快捷的遺傳操作是研究病原菌生長(zhǎng)、代謝和致病機(jī)制的關(guān)鍵，因此開(kāi)發(fā)豬鏈球菌的遺傳操縱工具對(duì)該病原菌的病原學(xué)和致病機(jī)制研究具有重要意義。目前，在豬鏈球菌中，常用的基因突變菌株的構(gòu)建方法是采用傳統(tǒng)的同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)，其可以定向缺失基因組的特定片段或?qū)⒛康钠味ㄏ虿迦肴旧w特定位點(diǎn)。但是，該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量突變體構(gòu)建，也不能實(shí)現(xiàn)隨機(jī)突變。

隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變技術(shù)是通過(guò)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到染色體中，破壞插入位置原有基因的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因突變的一種遺傳操作。近年來(lái)，將隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變技術(shù)與二代DNA測(cè)序技術(shù)相結(jié)合開(kāi)發(fā)出的轉(zhuǎn)座插入測(cè)序技術(shù)為全基因組范圍內(nèi)篩選功能基因提供了新的思路。在豬鏈球菌中，有研究使用Tn917轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，但該轉(zhuǎn)座子被認(rèn)為具有一定的插入偏好性。因此，本研究構(gòu)建了一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)pSET4s-Tn，其攜帶Mariner轉(zhuǎn)座酶以及包含紅霉素抗性表達(dá)盒的插入元件，通過(guò)本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在豬鏈球菌中高效構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體，轉(zhuǎn)座子插入在細(xì)菌染色體的TA位點(diǎn)，且插入位點(diǎn)無(wú)明顯偏好性。目前并未檢索到豬鏈球菌中有類似的高效隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)可高效構(gòu)建豬鏈球菌轉(zhuǎn)座突變體及突變體文庫(kù)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種Mariner轉(zhuǎn)座酶表達(dá)盒，包括一個(gè)gapdh基因啟動(dòng)子和Mariner轉(zhuǎn)座酶的編碼序列，其在豬鏈球菌中表達(dá)Mariner轉(zhuǎn)座酶，所述gapdh基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，所述轉(zhuǎn)座酶基因Mariner的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

一種豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)，包含由上述的Mariner轉(zhuǎn)座酶表達(dá)盒、抗性表達(dá)盒組成的基因片段Tn，以及質(zhì)粒，所述抗性表達(dá)盒由抗性基因及兩側(cè)的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列組成，兩側(cè)的所述轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列分別如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，抗性表達(dá)盒可被Mariner轉(zhuǎn)座酶識(shí)別后將該抗性表達(dá)盒插入至豬鏈球菌染色體的TA堿基位點(diǎn)。

進(jìn)一步地，所述抗性表達(dá)盒為紅霉素抗性表達(dá)盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

而且，所述紅霉素抗性表達(dá)盒使得含有該質(zhì)粒的豬鏈球菌具有紅霉素抗性。

進(jìn)一步地，所述基因片段Tn的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步地，所述基因片段Tn插入pSET4s質(zhì)粒中形成所述豬鏈球菌高效轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)，即pSET4s-Tn質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，所述pSET4s質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有如下基因片段：豬鏈球菌溫敏復(fù)制元件Ts ori、大腸桿菌復(fù)制元件ColE1 ori、壯觀霉素抗性表達(dá)盒。