[發(fā)明專利]一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210405664.0
• 申請日: 2022-04-18
• 公開（公告）號: CN114686421B
• 公開（公告）日: 2023-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔逸鴻;葉浩;韋秋君;王奇璇;羅語溪;李燕;曹聰;李晉澤
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/00;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44367
• 代理人: 高冰

本發(fā)明屬于組織工程生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明首先對肺組織通過乙醇進(jìn)行交聯(lián)固定后，再使用SDS和trypsin/EDTA進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后使用胃蛋白酶進(jìn)行消化處理后制備得到一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體。本發(fā)明提供的肺脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體，材料來源廣泛易得，制備方式簡單，反應(yīng)無毒無害，且所制備的肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)不僅保留了大量的I型膠原、IV型膠原，層粘連蛋白、纖連蛋白和彈性蛋白，而且具有與體內(nèi)微環(huán)境相似的結(jié)構(gòu)，具有良好的細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞的繁殖，有望用于間充質(zhì)干細(xì)胞的體外大規(guī)模生產(chǎn)，在組織工程領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用前景及實用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織工程生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有高度自我更新能力及多向分化潛能，且具有易分離，低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)的特性，使其成為組織工程領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。MSCs的臨床應(yīng)用需要數(shù)十億的細(xì)胞，而MSCs目前的培養(yǎng)主要是采用傳統(tǒng)的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方式，這種二維培養(yǎng)方式無法滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求，且難以模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境，一來會損害MSCs的自我更新能力，使得MSCs的擴(kuò)增效率降低，二來會致使MSCs細(xì)胞老化，發(fā)生“自發(fā)性”分化，損害其多向分化潛能，從而使MSCs在科研和臨床的應(yīng)用中面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

目前，利用三維支架系統(tǒng)對各項組織工程材料進(jìn)行培養(yǎng)已取得了一定的研究進(jìn)展，并且在MSCs的體外培養(yǎng)中展現(xiàn)出了一定的效果。三維培養(yǎng)由于模擬了細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，從而增強(qiáng)了單層培養(yǎng)中觀察不到的細(xì)胞活性。而去細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)是最接近天然組織的支架材料，它具有天然組織中的復(fù)雜成分，包括膠原蛋白、粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等，而且具有與體內(nèi)微環(huán)境相似的三維結(jié)構(gòu)和柔韌性。同時，經(jīng)脫細(xì)胞處理后原有細(xì)胞留下的空間能為后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)提供足夠的生長空間。此外，細(xì)胞分泌的(extracellular matrix,細(xì)胞外基質(zhì))能在體外重建，并模擬體內(nèi)的微環(huán)境，從而通過調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞在ECM中的細(xì)胞行為，從而影響間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新能力和定向分化潛能。然而，三維支架系統(tǒng)在展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢的同時，也給MSCs的生產(chǎn)帶來了重大挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在：(1)使用來自人類或動物組織的未定義成分，可能會導(dǎo)致批次間的差異，并造成病原體和免疫原轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，從而阻礙細(xì)胞生產(chǎn)的良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)；(2)大量細(xì)胞聚集可能導(dǎo)致MSCs分化或衰老；(3)長期連續(xù)擴(kuò)增的不可預(yù)測后果。因此，為解決三維支架系統(tǒng)存在的上述問題，微載體培養(yǎng)應(yīng)運而生。

微載體具有微米級的尺寸、較大的比表面積、負(fù)載能力強(qiáng)、可增強(qiáng)細(xì)胞粘附和浸潤等特點，使其能夠使用最小的空間，花費較少的費用來擴(kuò)增大量的細(xì)胞，而且微載體還允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的有效運輸，從而提高細(xì)胞間的相互作用。目前，微載體已被廣泛應(yīng)用于可注射水凝膠、細(xì)胞及分子載體和疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域。此外，基于微載體的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是相對靈活的，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的產(chǎn)量，還可以集成到現(xiàn)有的生物培養(yǎng)系統(tǒng)(如攪拌式生物反應(yīng)器)中，有利于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的實時監(jiān)控，保證不同批次細(xì)胞的穩(wěn)定性，實現(xiàn)干細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)。然而，現(xiàn)有的微載體大部分存在細(xì)胞相容性差的問題，導(dǎo)致其應(yīng)用受到了一定的制約。因此，有必要開發(fā)具有良好生物相容性的微載體。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的首要目的是提供一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體的制備方法。

本發(fā)明的第二個目的是提供采用上述制備方法制備得到的肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體及其應(yīng)用。

本發(fā)明的上述第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種肺組織脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體的制備方法，具體為：首先利用乙醇使肺組織中的蛋白交聯(lián)固定，然后使用SDS(十二烷基硫酸鈉)和trypsin/EDTA進(jìn)行脫細(xì)胞處理，脫細(xì)胞后再用NaCl溶液和明膠溶液去除殘留試劑，最后使用胃蛋白酶溶液消化制備得到脫細(xì)胞外基質(zhì)微載體。