[發(fā)明專利]一種‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法及應(yīng)用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210387428.0
• 申請(qǐng)日: 2022-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN114521493A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石海燕;徐悅;霍利月;李曉娜;楊雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟S10：采集‘秋月梨’的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；

步驟S20：將放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后將花蕾中的花藥取出，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30~50天，獲得花藥愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+1.3~1.7 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L 6-BA+6~8 g/L瓊脂，pH 5.8~6.2；

步驟S30：將誘導(dǎo)出的花藥愈傷組織接種增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而獲得愈傷組織，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+0.8~1.2 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L 6-BA+6~8 g/L瓊脂，pH 5.8~6.2。

2.如權(quán)利要求1所述的‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L瓊脂，pH 5.8~6.2；所述增殖培養(yǎng)基為1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L瓊脂，pH 5.8~6.2。

3.如權(quán)利要求1所述的‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，在所述步驟S20中，所述清洗為用無(wú)菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰塵；所述消毒為使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgCl₂處理8~10 min，無(wú)菌水清洗3~5次后用無(wú)菌濾紙吸干花蕾表面水分。

4.如權(quán)利要求1所述的‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，在步驟S20中，所述暗培養(yǎng)的溫度為25±2℃。

5.如權(quán)利要求1所述的‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，在所述步驟S30中，所述增殖培養(yǎng)在暗環(huán)境中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為25±2℃，每30~40天進(jìn)行一次繼代。

6.一種‘秋月梨’愈傷組織的應(yīng)用方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟S40：使用攜帶外源基因的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織，然后接種到共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天；所述愈傷組織通過(guò)如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的‘秋月梨’愈傷組織的誘導(dǎo)方法獲得，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2 ,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L瓊脂，pH 5.8~6.2；

步驟S50：步驟S40的暗培養(yǎng)結(jié)束后使用脫菌液洗滌2~3次，無(wú)菌水洗滌3~5次，在無(wú)菌濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中篩選，得到抗性愈傷組織，所述脫菌液為：1/2MS+20g/L蔗糖+300 mg/L頭孢霉素。

7.如權(quán)利要求6所述的‘秋月梨’愈傷組織的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟S40中所述轉(zhuǎn)化的條件為：使用攜帶外源基因的根癌農(nóng)桿菌的重懸液浸泡所述愈傷組織并搖晃侵染8~10 min，重懸液中乙酰丁香酮AS工作濃度為200 μmol/L。

8.如權(quán)利要求6所述的‘秋月梨’愈傷組織的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟S40中所述暗培養(yǎng)的溫度為25±2℃。

9.如權(quán)利要求6所述的‘秋月梨’愈傷組織的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟S50中，所述篩選培養(yǎng)基為：1/2MS+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+1.0 mg/L2 ,4-D+1.0 mg/L 6-BA+300mg/L頭孢霉素+6 mg/L潮霉素。