[發明專利]長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應用

有效

• 申請號: 202210378335.1
• 申請日: 2022-04-12
• 公開（公告）號: CN114703231B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 張琳琳;張韋;許悅;產久林
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/12
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 牛繼梅;高洋

本發明公開了一種長牡蠣β?tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應用，屬于基因編輯技術領域。本發明的長牡蠣β?tubulin基因的電穿孔基因編輯方法是在長牡蠣受精卵出現第一極體10min內完成電穿孔實驗，對長牡蠣β?tubulin基因進行電穿孔基因編輯；其中，電穿孔實驗體系中sgRNA和Cas9蛋白復合物中sgRNA與Cas9蛋白終濃度為30ng/μL；電穿孔實驗參數為40V/50ms。在該條件下，能夠獲得長牡蠣β?tubulin基因的高編輯效率和幼蟲的高存活率，并且可以降低sgRNA和Cas9蛋白使用量；降低時間成本和人力成本。

技術領域

本發明屬于基因編輯技術領域，具體涉及一種長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應用。

背景技術

牡蠣隸屬雙殼綱，軟體動物門，營固著生活，濾食，在全世界各地沿海地區都有分布。牡蠣作為全世界重要的水產養殖經濟貝類，肉質鮮美，營養豐富，而且具有一定的藥用價值和保健功能。長牡蠣(Crassostrea gigas)目前是我國主要的經濟貝類養殖種類。

基因編輯技術是揭示基因功能最有效的方法，目前基因編輯技術在基因功能研究中已經得到廣泛應用，應用最為廣泛的是CRISPR/Cas9基因編輯技術，即規律成簇的間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)。作為一種基因編輯工具，CRISPR系統能夠定點修飾基因組，與TALENs、ZFNs基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術因具有操作簡單、靶點選擇廣、成本低和效率高等優點，CRISPR系統已被廣泛應用于藥物研制、疾病治療、動物模型和生物遺傳育種等方面。

目前CRISPR/Cas9基因編輯技術主要借助顯微注射或者電穿孔方法等將sgRNA和Cas9導入受精卵。顯微注射技術，通量比較小，較為費時費力。電穿孔方法有通量大、省時省力的優點。目前海洋經濟貝類基因編輯技術仍然發展較為緩慢，有幾例報道僅見于胚胎操作較易的腹足類，雙殼類僅有兩例基因編輯報道。牡蠣受精卵大小在40μm左右，相比于顯微注射導入外源物質，選用電穿孔方法進行CRISPR/Cas9基因編輯更高效。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明要解決并優化牡蠣中電穿孔CRISPR/Cas9基因編輯技術，找到最優參數實現高存活率，高編輯效率；調整sgRNA和Cas9蛋白用量，降低目前電穿孔方法的sgRNA和Cas9蛋白使用量；電穿孔方法的優化，降低時間成本和人力成本；提供了β-tubulin基因作為經濟貝類基因編輯體系構建標記基因的先例。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法，步驟如下：

篩選長牡蠣親貝，解剖獲取卵子和精子，在26℃海水中進行人工授精，精卵比例為3-5:1；授精完成后，觀察第一極體出現時間，出現第一極體10min內完成電穿孔實驗，對長牡蠣β-tubulin基因進行電穿孔基因編輯；電穿孔實驗后的受精卵放入天然海水中，26℃恒溫培養；將電穿孔基因編輯處理后的受精卵培育至8h-11h，取樣進行基因型和表型突變的檢測；

其中，100μL電穿孔實驗體系包含電轉緩沖液60μL，sgRNA和Cas9蛋白復合物10μL，受精卵30μL；電轉緩沖液為使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白復合物中sgRNA與Cas9蛋白終濃度為15-45ng/μL；受精卵的濃度為1000個/μL；

電穿孔實驗參數為36-250V/0.1-50ms。

在一個具體的實施例中，所述電穿孔實驗參數為36V/10ms；40V/10ms；40V/40ms；40V/50ms；60V/40ms；70V/20ms；80V/25ms；80V/30ms；90V/22ms；200V/0.3ms；250V/0.1ms；優選的為40V/50ms。