[發明專利]長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應用

有效

• 申請號: 202210378335.1
• 申請日: 2022-04-12
• 公開（公告）號: CN114703231B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 張琳琳;張韋;許悅;產久林
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/12
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 牛繼梅;高洋

1.一種長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法，其特征在于，步驟如下：

篩選長牡蠣親貝，解剖獲取卵子和精子，在26℃海水中進行人工授精，精卵比例為3-5:1；授精完成后，觀察第一極體出現時間，出現第一極體10min內完成電穿孔實驗，對長牡蠣β-tubulin基因進行電穿孔基因編輯；電穿孔實驗后的受精卵放入天然海水中，26℃恒溫培養；將電穿孔基因編輯處理后的受精卵培育至8h-11h，取樣進行基因型和表型突變的檢測；

其中，100μL電穿孔實驗體系包含電轉緩沖液60μL，sgRNA和Cas9蛋白復合物10μL，受精卵30μL；電轉緩沖液為使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白復合物中sgRNA與Cas9蛋白終濃度為15-45ng/μL；受精卵的濃度為1000個/μL；

電穿孔實驗參數為36-250V/0.1-50ms。

2.根據權利要求1所述長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法，其特征在于，所述電穿孔實驗參數優選的為40V/50ms。

3.根據權利要求1所述長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白復合物中sgRNA與Cas9蛋白終濃度為30ng/μL。

4.根據權利要求1-3任一項所述長牡蠣β-tubulin基因的電穿孔基因編輯方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白復合物由以下方法獲得：

(1)根據SEQ ID NO:1所示的長牡蠣β-tubulin基因的核酸序列，設計長牡蠣β-tubulin基因的兩個sgRNA位點，靶位點分別如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

(2)針對上述兩個靶位點，依據sgRNA引物設計原則，設計長牡蠣β-tubulin基因sgRNA引物分別如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；

(3)使用特異性引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5與通用引物合成sgRNAs的DNA模板；進行體外轉錄獲得長牡蠣β-tubulin基因的sgRNA1和sgRNA2；

(4)將sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按照濃度配比為1:1:1混合制得sgRNA和Cas9蛋白復合物。

5.β-tubulin基因作為經濟貝類基因編輯體系構建中的標記基因的應用。