[發明專利]一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養基及培養方法

在審

• 申請號: 202210374437.6
• 申請日: 2022-04-11
• 公開（公告）號: CN114591903A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 王建波;劉韜;王長亮;李利利;翁平
• 申請（專利權）人: 江蘇育瑞康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 深圳市廣諾專利代理事務所(普通合伙) 44611
• 代理人: 張曉璐

1.一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養基，其特征在于：包含90～95％的DMEM/12、5-10％血清替代物，并添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、地塞米松和白介素10(IL10)。

2.根據權利要求1所述的一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養基，其特征在于：所述地塞米松的用量為10^-10～10^-11mol/L，EGF的用量為10～40ng/ml，bFGF的用量為5～15ng/ml，IL10的用量為20～60ng/ml。

3.一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一：選取胎盤絨毛膜干細胞作為培養CD106陽性細胞的初始細胞；

步驟二：通過配置如權利要求1所述的一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養基，將胎盤絨毛膜干細胞置于上述培養基進行表達培養，在培養過程中使得胎盤絨毛膜干細胞始終處于CD106表達的狀態，并使得胎盤絨毛膜干細胞CD106表達比例持續增加，最終達到CD-106表達高于85％的狀態。

4.根據權利要求3所述的一種促進CD106陽性細胞穩定表達的培養方法，其特征在于：步驟一的具體操作為：

取新鮮胎盤，從胎膜中分離出絨毛膜層，使用組織剪將絨毛膜層剪碎成肉糜狀，再使用4ng/ml的膠原酶II與組織混合，比例為按5g組織使用10ml膠原酶II，并在恒溫搖床消化1小時，設置溫度參數為37℃、轉速參數為150RPM，消化完成后使用輸血器過濾掉殘余組織，將細胞懸液使用生理鹽水清洗兩遍，即可獲得胎盤絨毛膜干細胞，部分雜細胞將在傳代時剔除。

5.根據權利要求4所述的一種促進間充質干細胞穩定表達CD106陽性細胞的培養方法，其特征在于：步驟二的具體操作為：

將步驟一獲得的胎盤絨毛膜干細胞置于定向培養基，培養于175培養瓶中，培養基采用包含90～95％的DMEM/12和5-10％血清替代物，血清替代物為Helios UltraGRO血清替代物，并添加地塞米松、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、白介素10(IL10)，接種第二天換液，后期每3天全換液一次，待細胞培養至融合度90％以上后傳代，傳代至P1代時，流式檢測CD106表達率，CD106表達高于30％則繼續培養，否則丟棄重新制備；

還包括步驟三，傳代后繼續培養，CD106將持續增長，P4～P6代時CD106表達將達到85％以上，收獲細胞前24h加入干擾素-γ及腫瘤壞死因子-α。