[發明專利]一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法

有效

• 申請號: 202210370256.6
• 申請日: 2022-04-09
• 公開（公告）號: CN114703225B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 宋廣樹;呂慶雪;周迎鑫;孫蕾;周德龍
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 田立媛

本發明公開了一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，屬于基因工程技術領域。本發明公開的一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，通過CRISPR/Cas9技術對玉米ZmIsa2、ZmIsa3、ZmZpu1基因同時進行基因編輯，并進一步篩選獲得含目的基因突變片段的突變體材料，這些玉米籽粒類胡蘿卜素含量提高的材料具有重要的育種價值。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體的說是涉及一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法。

背景技術

類胡蘿卜素是一類具有獨特結構和功能的重要天然色素，在光養和非光養生物中廣泛分布，目前已經有超過700種天然類胡蘿卜素被鑒定，其化學多樣性非常豐富。類胡蘿卜素通過化學或酶轉化成其他衍生物，如維生素A、植物激素或芳香類化合物等；維生素A缺乏癥是全世界主要微量營養素缺乏癥之一。研究表明富含類胡蘿卜素的飲食(主要由水果和蔬菜組成)具有促進健康作用，同時有助于降低患某些癌癥及心血管、眼睛、皮膚或骨骼疾病的風險。由于類胡蘿卜素無法通過人體自身合成，而是在食物中與其他分子如糖類、蛋白質或脂肪酸相結合從而被人體攝取，因此研究人體從膳食中攝取及吸收類胡蘿卜素的效率及其影響因素至關重要。

類胡蘿卜素還作為飼料添加劑，對動物正常生長、發育具有特殊意義，如常見的“無癥狀”發熱、延期排卵、卵泡囊腫、黃體減少以及胎盤停滯、繁殖發育障礙等癥狀，添加后均可得到很大程度的改善。另外，產蛋雞在添加富含類胡蘿卜素的飼料后，提高產蛋率的同時蛋黃顏色也會加深，提高其營養價值。本發明可以使普通玉米籽粒中類胡蘿卜素含量提高2倍，具有重要的飼用價值。

傳統高胡蘿卜素玉米材料的創制主要是通過回交轉育的方法，往往需要經過6個回交世代，不僅耗時長，同時經常伴隨基因冗余，導致一些非目標性狀的導入，限制了改良材料的應用效果。

類胡蘿卜素是人類發現的第一種天然色素，類胡蘿卜素長鏈分子的主鏈通常是由9～11個共軛C＝C鍵構成，其線性鏈的長度對應于分子鉚釘穿透膜的疏水區的厚度，從而在某些真菌與動物體內起到增強細胞膜脂質功能的作用。類胡蘿卜素通常根據分子組成分為兩類：一類指在多烯主鏈的一端或兩端有碳氫環的非極性類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、番茄紅素)，另一類是指結構中具有含氧基團-OH(如葉黃素)，＝O(如斑蝥黃素)，OH與＝O的結合(如蝦青素)，或醇酯(如巖藻黃素)的極性類胡蘿卜素。在生物體所含天然磷脂雙分子層膜中，分子兩端帶有羥基和/或氧基的極性類胡蘿卜素如葉黃素，以垂直于磷脂膜表面的長軸方向定位于磷脂的極性頭，將導致脂質烷基鏈的運動自由度降低，模型膜和生物膜中水和氧的通透性降低，這些效應被稱為膜中的固化效應；而不含氧的β-胡蘿卜素中對稱的脂肪鏈與磷脂的非極性部分發生非共價結合，增加磷脂頭極性基團的運動自由度，導致膜結構的流動性增強，因此類胡蘿卜素的數量與種類是影響膜功能的重要參數。類胡蘿卜素的機械特性在進化后期用于保護蛋白質的相關結構，暴露的類胡蘿卜素外部結構能夠與蛋白質相互結合，從而對環境條件產生一定抵抗性。

因此，提供一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用基因編輯技術提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，具體步驟如下：

(1)針對基因ZmIsa2設計基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位點；

所述sgRNA作用位點的核苷酸序列為：

ZmIsa2：5’-GCGGAGATACGGACACACCGCGG-3’；SEQ?ID?NO.4；

(2)以pCBC-MT1T2質粒為模板，MT1T2-F，MT1T2-F0為引物，PCR擴增目的片段；