[發(fā)明專利]一種利用基因編輯技術(shù)提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210370256.6
• 申請日: 2022-04-09
• 公開（公告）號: CN114703225B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋廣樹;呂慶雪;周迎鑫;孫蕾;周德龍
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 田立媛

1.一種利用基因編輯技術(shù)提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)針對基因ZmIsa2設(shè)計基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位點；

所述sgRNA作用位點的核苷酸序列為：

ZmIsa2：5’-GCGGAGATACGGACACACCGCGG-3’；SEQ?ID?NO.4；

(2)以pCBC-MT1T2質(zhì)粒為模板，MT1T2-F，MT1T2-F0為引物，PCR擴增目的片段；

所述引物序列如下：

MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGCCTTTGATGAACTGACGCA-3’；SEQ?ID?NO.5；

MT1T2-F0：5’-GCCTTTGATGAACTGACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQ?ID?NO.6；

(3)針對基因ZmIsa3、ZmZpu1設(shè)計基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位點；

所述sgRNA作用位點的核苷酸序列為：

ZmIsa3：5’-ACCACGACGAAAGTTCAGAGCGG-3’；SEQ?ID?NO.7；和

ZmZpu1：5’-TGGTCAGACTGAGAACAGCGCGG-3’；SEQ?ID?NO.8；

(4)以pCBC-MT1T2質(zhì)粒為模板，MT1T2-F’，MT1T2-F0’，MT1T2-R0’，MT1T2-R’為引物，PCR擴增目的片段；

所述引物序列如下：

MT1T2-F’：5’-AATAATGGTCTCAGGCGCCACGACGAAAGTTCAGAG-3’；SEQ?ID?NO.9；

MT1T2-F0’：5’-GCCACGACGAAAGTTCAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQ?ID?NO.10；

MT1T2-R0’：5’-CGCTGTTCTCAGTCTGACCCGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQ?ID?NO.11；

MT1T2-R’：5’-ATTATTGGTCTCTAAACCGCTGTTCTCAGTCTGACC-3’；SEQ?ID?NO.12；

(5)將步驟(2)和步驟(4)獲得的目的片段分別與載體pBUE411進行酶切連接，分別構(gòu)建得到ZmIsa2基因編輯載體pBUE411-1gR-ZmIsa2和ZmIsa3、ZmZpu1基因編輯載體pBUE411-2gR-ZmIsa3-ZmZpu1；

(6)將步驟(5)獲得的基因編輯載體pBUE411-1gR-ZmIsa2和pBUE411-2gR-ZmIsa3-ZmZpu1分別單獨轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，進行玉米遺傳轉(zhuǎn)化，獲得pBUE411-1gR-ZmIsa2載體陽性植株和pBUE411-2gR-ZmIsa3-ZmZpu1載體陽性植株；經(jīng)雜交和自交以及篩選鑒定獲得類胡蘿卜素含量高的玉米材料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因編輯技術(shù)提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于，步驟(2)所述PCR擴增反應(yīng)體系為：pCBC-MT1T2質(zhì)粒1μl，MT1T2-F0.5μl，MT1T2-F00.5μl，2×Mix?10μl，ddH₂O?8μl；PCR擴增反應(yīng)程序為：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min，4℃∞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因編輯技術(shù)提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于，步驟(4)所述PCR擴增反應(yīng)體系為：pCBC-MT1T2質(zhì)粒1μl，MT1T2-F’0.5μl，MT1T2-F0’0.5μl，MT1T2-R0’0.5μl，MT1T2-R’0.5μl，2×Mix?10μl，ddH₂O?7μl；PCR擴增反應(yīng)程序為：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min，4℃∞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因編輯技術(shù)提高玉米籽粒類胡蘿卜素含量的方法，其特征在于，步驟(5)所述酶切連接反應(yīng)體系如下：目的片段2μl，pBUE4112μl，10xNEBT4?Buffer?1.5μl，10xBSA?1.5μl，BsaI?1μl，T4?Ligase?1μl，ddH₂O?6μl，Total?15μl。