[發明專利]一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法在審
| 申請號： | 202210369746.4 | 申請日： | 2022-04-08 |
| 公開（公告）號： | CN114591992A | 公開（公告）日： | 2022-06-07 |
| 發明（設計）人： | 張懷東;劉峰;孟帥帥;臧珊珊 | 申請（專利權）人： | 福建師范大學 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/54;C12P13/22;C12N1/21;C12R1/19 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 高產 色氨酸 低產 丙氨酸 大腸桿菌 構建 方法 | ||
本發明公開了一種高產L?色氨酸且低產L?丙氨酸的大腸桿菌構建方法，根據大腸桿菌
技術領域
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法。
背景技術
作為人和動物所必須的20種氨基酸之一，L-色氨酸(L-Tryptophan,L-Trp)在人和動物體內無法合成，只能從植物和微生物中獲取。L-色氨酸被廣泛應用于醫藥、食品和飼料等行業。
L-色氨酸的生產方法有蛋白質水解法、化學合成法、微生物轉化法以及微生物發酵法。目前國內外主要利用微生物發酵的方法用以生產L-色氨酸，其中主要平臺的微生物有大腸桿菌以及谷氨酸棒桿菌等菌株；在菌株的選育過程中通常通過物理誘變或化學誘變并結合代謝工程理論和基因工程等方法，來選育能夠高產L-色氨酸的工程菌株。大腸桿菌作為L-色氨酸發酵的重要平臺微生物之一，在L-色氨酸發酵工程工業中起著舉足輕重的作用。
大腸桿菌生產L-色氨酸的過程中往往會伴隨著副產物的生成，副產物的積累不僅會造成碳源的浪費還可能會對目標產物純化及回收帶來難題，甚至還會對菌體的生長代謝產生潛在危害。減少副產物的產生不僅能夠減少副產物對菌體的潛在的危害還能夠明顯增加目標產物的產量。
在大腸桿菌復雜的代謝途徑中氨基酸穩態維持并調節著其細胞本身氨基酸庫的平衡，L-丙氨酸通過可逆的轉氨基反應途徑，如發酵(通過丙酮酸)或氮代謝(通過天冬氨酸和谷氨酸)等連接著這條關鍵的代謝網絡。在大腸桿菌體內丙酮酸既是L-丙氨酸合成的前體物質又是3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸的合成過程中的直接供體。在菌株發酵過程中，若在丙氨酸大量合成的情況下，丙酮酸的消耗將隨之增加，從而使得3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸的合成也將隨之減少，L-色氨酸的合成勢必也將受到一定影響。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，包括如下步驟：
(1)根據GenBank中已公布的大腸桿菌E.coli K-12丙氨酸轉氨酶基因中alaA(Gene ID:946772)和alaC(Gene ID:946850)的序列信息，分別設計帶有同源臂的敲除引物對alaA-F1/alaA-R1、alaC-F1/alaC-R1，以質粒pKD13為模板、丙氨酸轉氨酶各基因的敲除引物對為引物進行PCR擴增反應，分別擴增出含有卡那霉素抗性基因且與alaA或alaC基因同源的基因片段，PCR反應結束后，于反應產物中按比例加入Dpn I酶，37℃處理1h后于80℃水浴中放置10min終止反應，試劑盒回收產物片段并送去測序；
所述alaA-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述alaA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述alaC-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述alaC-R1的序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)含pKD46電轉化感受態的制備及同源基因片段的電轉化
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