[發明專利]一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法

在審

• 申請號: 202210369746.4
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114591992A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 張懷東;劉峰;孟帥帥;臧珊珊
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12P13/22;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)根據GenBank中已公布的大腸桿菌E.coli K-12丙氨酸轉氨酶基因中alaA(GeneID:946772)和alaC(Gene ID:946850)的序列信息，分別設計帶有同源臂的敲除引物對alaA-F1/alaA-R1、alaC-F1/alaC-R1，以質粒pKD13為模板、丙氨酸轉氨酶各基因的敲除引物對為引物進行PCR擴增反應，分別擴增出含有卡那霉素抗性基因且與alaA或alaC基因同源的基因片段，PCR反應結束后，于反應產物中按比例加入Dpn I酶，37℃處理1h后于80℃水浴中放置10min終止反應，試劑盒回收產物片段并送去測序；

所述alaA-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述alaA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述alaC-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述alaC-R1的序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)含pKD46電轉化感受態的制備及同源基因片段的電轉化

挑取含有pKD46質粒的菌株接種于含氨芐青霉素的LB液體搖瓶培養基中，30℃培養過夜，取500μL過夜培養的菌液接種于LB液體搖瓶培養基內，30℃條件下振蕩培養至細胞OD₆₀₀＝0.1-0.2，加入一定量過濾除菌的L-阿拉伯糖誘導劑，繼續培養至細胞OD₆₀₀＝0.7-0.8時停止培養，迅速放至冰上預冷30-35min，離心并用滅過菌的10％的甘油洗滌兩次，取100-200μL洗滌后的細胞，和步驟(1)中含有卡那霉素抗性基因且與alaA或alaC基因同源的基因片段混合后加至電轉杯內，進行電擊，電擊結束后迅速加入SOC復蘇培養基，混勻后接種至無菌的離心管中，37℃，100-120r/min振蕩培養1.5-2.0h，無菌條件下，將復蘇后的菌液涂布于含卡那霉素抗性的LB固體平板上，待菌落長至一定大小后篩選陽性轉化子；

(3)陽性轉化子的篩選

采用驗證引物，通過菌落PCR進行驗證，驗證陽性轉化子是否成功發生同源重組；

(4)卡那霉素抗性基因和質粒pCP20的消除

挑取目的基因成功被卡那霉素基因取代的單菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體搖瓶培養基中，37℃條件下過夜培養，制備電轉感受態細胞，依然通過電轉化的方法將質粒pCP20電轉入感受態細胞，加入SOC復蘇培養基復蘇1.5-2.0h后涂布于含氨芐青霉素的LB固體平板上，30℃培養菌落至合適大小，挑取平板上的單菌落接種于不含任何抗性的LB液體培養基上，30℃培養3h迅速升溫至42℃過夜培養，挑取少許菌液劃線于不含抗性的LB固體平板上，37℃靜置培養，待菌落長至一定大小后再次分別使用驗證引物alaC-F1-F/alaC-R1-R進行菌落PCR，篩選目的基因已被敲除的陽性轉化子。

2.根據權利要求1所述的一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，其特征在于：步驟(2)中，LB液體搖瓶培養基內的氨芐青霉素終濃度為100μg/mL。

3.根據權利要求1所述的一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，其特征在于：步驟(2)中，離心轉速為6000-6500r/min，電擊電壓為2500-2600V。

4.根據權利要求1所述的一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，其特征在于：步驟(3)中，以alaA-F1-F/check-R和alaC-F1-F/check-R為驗證引物，所述alaA-F1-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述alaC-F1-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述check-R的序列如SEQ ID NO.9所示。

5.根據權利要求1所述的一種高產L-色氨酸且低產L-丙氨酸的大腸桿菌構建方法，其特征在于：步驟(4)中，以alaA-F1-F/alaA-R1-R、alaC-F1-F/alaC-R1-R為驗證引物，所述alaA-F1-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述alaA-R1-R的序列如SEQ ID NO.6所示，所述alaC-F1-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述alaC-R1-R的序列如SEQ ID NO.8所示。