[發(fā)明專利]一種非人類胚胎細胞的冷凍優(yōu)化體系及應用

有效

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• 申請日: 2022-04-06
• 公開（公告）號: CN114617121B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張靜;常在;劉世景
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/073
• 代理公司: 北京知聯(lián)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11594
• 代理人: 韓藝珠

本發(fā)明公開了一種非人類胚胎細胞的冷凍優(yōu)化體系及應用。該體系采用了平衡液、冷凍液和解凍液組合，使三種液體組成一個胚胎細胞的凍存及復蘇體系，有利于保持胚胎細胞處于穩(wěn)定的環(huán)境中。利用本發(fā)明的體系，提高了凍存胚胎細胞復蘇后的發(fā)育率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物保種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非人類胚胎細胞的冷凍體系及應用。

背景技術(shù)

隨著各種基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是在實驗動物行業(yè)中出現(xiàn)了各種珍貴的基因修飾品系，保存這些品系的生物保種技術(shù)也被廣泛應用，探尋更高效成功率的保種技術(shù)值得更深入的研究。

冷凍技術(shù)主要包括慢速冷凍技術(shù)和玻璃化冷凍技術(shù)，慢速冷凍技術(shù)的低成活率限制了該方法在生物保種技術(shù)中的應用。1985年，Rall和Fahy提出玻璃化冷凍技術(shù)之后，玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于各種實驗動物的胚胎冷凍中。玻璃化冷凍技術(shù)(Vitrification)是指在室溫將胚胎放置高濃度的冷凍保護劑中快速轉(zhuǎn)入液氮中，而冷凍保護劑由液態(tài)形成一種類似玻璃的非結(jié)構(gòu)狀態(tài)，保持著正常的離子分布減少了對凍存胚胎的損傷。

玻璃化冷凍技術(shù)中高濃度冷凍保護劑和快速的冷凍速度是兩個關(guān)鍵步驟。濃度很高的冷凍保護劑具有一定的毒性，可能對胚胎造成一定的損傷，尋找毒性低的冷凍保護劑是提高冷凍效果的辦法之一。冷凍胚胎最終放置-196℃的液氮中，溫度跨度很大，低溫損傷冰晶的形成都是在這個過程中造成的，一般形成于-5℃到-80℃。極速的冷凍速度要求更簡單易操作的冷凍方式。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述的技術(shù)問題，提高冷凍保存的非人類胚胎細胞的成活率和發(fā)育率，降低胚胎細胞冷凍保存成本，簡化胚胎細胞的保種工序。本發(fā)明提供了一種非人類胚胎細胞的冷凍優(yōu)化體系及其應用，具體：

本發(fā)明第一方面，提供一種非人類胚胎細胞的冷凍優(yōu)化體系，所述優(yōu)化體系包括用于胚胎細胞冷凍的載體、胚胎細胞平衡液、胚胎細胞冷凍液和胚胎細胞解凍液。

優(yōu)選的，所述載體選自麥管(CS)、半麥管、OPS管、CPS管中的任意一種。

更優(yōu)選的，所述載體為半麥管，所述半麥管的一端具有從末端向中心斜向上的凹槽，所述凹槽可用于承載胚胎細胞，優(yōu)選的，所述凹槽長度1.0-1.5cm，寬度0.5～0.6mm。

優(yōu)選的，所述平衡液和冷凍液包括受精液(HTF)、丙二醇/DMSO；

更優(yōu)選的，所述平衡液包括血清、受精液、丙二醇/DMSO、和乙二醇；

進一步優(yōu)選的，所述平衡液包括血清15-25％、受精液60-70％、丙二醇/DMSO6.0-8.5％、和乙二醇6.0-8.5％；

上述組分可以是上述范圍內(nèi)的任一范圍或者任一值，例如：

血清：15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％等等。

受精液：60％、61％、62％、63％、64％、65％、67％、68％、69％、70％等等。

丙二醇或DMSO(丙二醇/DMSO)：6.0％、6.1％、6.3％、6.5％、6.8％、7.0％、7.5％、7.8％、8.0％、8.2％、8.5％等等。

乙二醇：6.0％、6.1％、6.3％、6.5％、6.8％、7.0％、7.5％、7.8％、8.0％、8.2％、8.5％等等。

優(yōu)選的，所述冷凍液包括血清、受精液(HTF)、丙二醇/DMSO、乙二醇和蔗糖。

更優(yōu)選的，所述冷凍液包括血清15-25％、受精液30-35％、丙二醇/DMSO12-17％、乙二醇12-17％和蔗糖0.15-0.25g/ml。

上述組分可以是上述范圍內(nèi)的任一范圍或者任一值，例如：