[發明專利]一種3D表皮模型的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202210365978.2
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114686420A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 單風娟;邢志青;王金鶴;王鑫玉;張平
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

本發明公開了一種3D表皮模型的制備方法及應用。本發明首先用Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白處理transwell小室的聚碳酸酯膜，棄掉Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白后將表皮細胞接種在小室的聚碳酸酯膜上，再經過浸沒和氣液培養得到成熟的3D表皮模型，且在角質細胞培養和表皮模型培養的初始階段中都使用ROCK inhibitor Y?27632維持角質細胞的干性，在氣液培養中加入脂肪酸、膽固醇和葡萄糖神經酰胺使構建的角質層更加完整。本發明的3D表皮模型制備方法簡單，相比常規方法，無需加基質層，無需加滋養層細胞，不會出現收縮的問題，屏障功能良好，可用于化妝品、藥品、生物制品等的安全性和功效性評價，也可用于皮膚科學的基礎研究。

技術領域

本發明屬于組織工程領域，涉及一種3D表皮模型的制備方法及應用。

背景技術

皮膚是人體最大的器官，是人體天然的保護屏障，可以抵御外界的刺激并保持人體內環境的穩定。皮膚由真皮層和表皮層組成，兩者之間由基底膜連接。其中真皮層由真皮成纖維細胞和膠原蛋白組成。表皮層包含由位于基底層的角質細胞不斷分化形成的4個層次，包括基底層、顆粒層、棘層和角質層。皮膚的屏障功能主要由表皮層的角質層在起作用，角質層是由角質細胞和脂質成分組成。

以往的化妝品刺激和腐蝕性實驗都是在動物身上實施的，對動物造成極大的痛苦甚至死亡；另外動物和人之間存在著種屬差異，動物實驗不能真實反映化妝品的安全性及有效性。隨著動物福利和3R原則的建立，同時歐盟制定了相關的法律法規禁止銷售使用動物實驗的化妝品和原料。2004年歐盟禁止銷售使用動物實驗的化妝品成品，2009年歐盟禁止使用動物做化妝品毒理實驗，2013年歐盟禁止使用動物做化妝品原料的安全性評價，并禁止進口和銷售使用動物實驗的化妝品和原料。所以，動物實驗替代方法的研究成為一種熱點和趨勢。越來越多的學者和商家開始開發3D體外檢測模型，可用于化妝品原料和成品的安全性和有效性檢測。

目前建立3D皮膚模型的方法很多，但建立的模型仍存在各種各樣的問題，如模型易收縮、制備工藝繁瑣、屏障功能較弱。比如，常見的表皮模型制備方法，包括加膠原基質層、加滋養層細胞，然后再接種表皮細胞，但這些方法步驟繁瑣、增加了表皮模型的制備周期，同時因缺少基底膜表皮層很容易脫落、模型容易收縮。

發明內容

針對現有方法的不足，本發明提供了一種新的3D表皮模型的制備方法，本發明首先用Ⅳ型膠原蛋白(0.5M醋酸溶解)和層粘連蛋白(磷酸鹽緩沖液溶解)處理transwell小室(面積0.47cm²)的聚碳酸酯膜，棄掉Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白后將表皮細胞接種在小室的聚碳酸酯膜上，再經過浸沒和氣液培養得到成熟的3D表皮模型。且在角質細胞培養和表皮模型初始階段中培養基中加入ROCK inhibitor Y-27632維持角質細胞的干性，在氣液培養中加入脂肪酸、膽固醇和葡萄糖神經酰胺使構建的角質層更加完整，同時表皮模型培養各個階段的培養基中還可以加入了我們濃縮的平常實驗室養真皮成纖維細胞時收集的真皮細胞培養基。因已經培養過真皮成纖維細胞的真皮細胞培養基中含有大量的真皮成纖維細胞分泌的真皮生長因子，可以為構建的表皮模型提供滋養。相比見的表皮模型制備方法(包括加膠原基質層、加滋養層細胞，然后再接種表皮細胞)，本發明的3D皮膚模型制備工藝簡單，無需加基質層，也無需加滋養層細胞，不會出現收縮的問題，屏障功能良好，可用于化妝品、藥品、生物制品等的安全性和功效性評價，也可用于皮膚科學的基礎研究。

本發明的技術方案是：一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)從包皮組織中分離出原代的角質細胞或復蘇原代的角質細胞，并用含有ROCKinhibitor Y-27632的角質細胞培養基培養角質細胞至P2/P3代；待細胞生長融合度達到80±5％時收集細胞，并用培養基a重懸角質細胞使其密度達到200±50萬/ml；