[發明專利]一種3D表皮模型的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202210365978.2
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114686420A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 單風娟;邢志青;王金鶴;王鑫玉;張平
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

1.一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)從包皮組織中分離出原代的角質細胞或復蘇原代的角質細胞，并用含有ROCKinhibitor Y-27632的角質細胞培養基培養角質細胞至P2或P3代；待細胞生長融合度達到80±5％時收集細胞，并用培養基a重懸角質細胞使其密度達到200±50萬/ml；

(2)取IV型膠原蛋白溶液和層粘連蛋白溶液包被transwell小室的聚碳酸酯膜；24±4h吸去IV型膠原蛋白和層粘連蛋白；

(3)每個transwell小室中接種重懸的角質細胞，小室外加入培養基a，使小室內外界面相平；

(4)用培養基a浸沒培養1～2天；

(5)用培養基b浸沒培養1～2天；

(6)用培養基b氣液培養11～13天，得到3D表皮模型。

2.如權利要求1所述的一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，所述含有ROCKinhibitor Y-27632的角質細胞培養基為：含ROCK inhibitor Y-27632 10～20μM、慶大霉素1-1.5％的角質細胞培養基。

3.如權利要求1所述的一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，

所述培養基a為含胎牛血清5％～10％、表皮生長因子0.1～0.3ng/ml、胰島素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、ROCK inhibitor Y-27632 10～20μM、慶大霉素1-1.5％的角質細胞培養基；

所述培養基b為含胎牛血清5％～10％、表皮生長因子0.1～0.3ng/ml、胰島素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、CaCl₂ 0.8～2.4mM、維生素C 45～60μg/ml、軟脂酸0.02～0.03mM、葡萄糖神經酰胺0.03～0.05mM、膽固醇0.02～0.04mM、亞油酸0.01～0.02mM、BSA 0.02～0.028mM、慶大霉素1-1.5％的角質細胞培養基。

4.如權利要求3所述的一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，所述培養基a或b中，每500ml角質細胞培養基，還加入2μg/ml的濃縮的真皮生長因子125μl～500μl，其中真皮生長因子為實驗室中已經培養過真皮成纖維細胞的真皮細胞培養基上清液的濃縮液。

5.如權利要求1-4中任一項所述的一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，所述步驟(2)取IV型膠原蛋白溶液和層粘連蛋白溶液包被transwell小室的聚碳酸酯膜具體為：取5～15μg/ml的IV型膠原蛋白溶液和10～20μg/ml層粘連蛋白溶液等體積來包被transwell小室的聚碳酸酯膜；所述IV型膠原蛋白溶液為將IV型膠原蛋白加入0.5M醋酸溶液中；層粘連蛋白溶液為將層粘連蛋白加入pH7.0-7.2磷酸鹽緩沖液中。

6.如權利要求1-4中任一項所述的一種3D表皮模型的制備方法，其特征是，所述步驟(3)每個面積0.47cm²的transwell小室中接種100μl～400μl重懸的角質細胞。

7.權利要求1-4中任一項所述的方法制備的3D表皮模型。

8.權利要求7所述的3D表皮模型在化妝品或者藥品的安全性評價中的應用。

9.權利要求7所述的3D表皮模型在化妝品功效性評價中的應用。

10.權利要求7所述的3D表皮模型在皮膚相關的基礎研究中的應用。