[發明專利]一種基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法

在審

• 申請號: 202210363235.1
• 申請日: 2022-04-07
• 公開（公告）號: CN114839381A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 馮致遠;張晶晶
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;C12N15/115;C12N15/113
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

本發明公開了一種基于CRISPR Cas13d基因編輯蛋白檢測急性心肌梗死標志物cTnI(心肌肌鈣蛋白I)的方法。樣品先于酶標板上孵育形成抗體?cTnI復合物，兩條ssDNA退火形成帶有T7啟動子序列的雙鏈cTnI DNA適配體，適配體與cTnI?抗體復合物孵育，結合形成抗體?cTnI?適配體三元夾心結構。該結構可被T7 RNA聚合酶識別并轉錄表達激活子RNA，并可被CRISPR Cas13d?crRNA復合物識別，激活產生的側切活性可有效切割RNA熒光報告分子產生一定的熒光信號。本發明首次基于Cas13d基因編輯蛋白應用于心肌標志物cTnI的精準檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術，特別涉及CRISPR Cas13d基因編輯蛋白體外檢測心肌肌鈣蛋白I的一種熒光檢測方法。

背景技術

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是一種臨床常見的心臟疾病，病因是心肌缺血性壞死造成急性冠狀動脈閉塞和血流中斷。因其較高的致死率和危害性，AMI的準確診斷具有相當重要的臨床價值。目前監測AMI的特異性心肌標志物有肌紅蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)。其中cTnI的心肌特異性最優，且在AMI發生后，心肌組織中的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)被迅速的釋放到血液中并能保持5-10天的時間窗口，因而可作為心臟損傷前篩查，也是AMI診斷最有效的途徑之一。通常認為cTnI在血液中的濃度大于0.5ng/ml時出現心肌損傷，AMI患者血液cTnI通常在1-25ng/ml的范圍內。

目前的cTnI檢測方法包括化學發光免疫分析(CN111308099A)、酶聯免疫吸附(ELISA)法、膠體金法、放射免疫測定法和化學發光法等。ELISA作為一種成熟的商用檢測方式，常用的檢測方式為抗體-待測分子-抗體的三明治夾心結構的一種比色檢測方式，但受限于高昂的檢測成本，目前亟需開發一種較為低廉的心肌標志物的檢測方法。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是古細菌進化出的一套RNA引導的適應性免疫系統，可實現特定靶標核酸序列的識別、錨定和切割。CRISPR-Cas基因編輯系統已經在基因組編輯、藥物遞送、基因治療、體外核酸診斷等領域實現了較為廣泛的應用。CRISPR Cas基因編輯系統包含基因靶向性的crRNA和Cas蛋白，當兩者形成核糖核酸復合物時可靶向特定的核酸序列并激活Cas蛋白的核酸酶切活性。其中，Cas13d是Cas系統中一類靶向RNA的Cas蛋白，具有脫靶效率低、蛋白結構緊湊等特點，相較于其他Cas蛋白沒有RNA側翼序列的要求，因而可以靶向任何RNA，故適用的范圍更廣。但是Cas13d目前的主要應用于細胞內mRNA沉默，其體外檢測應用尚未開發。核酸適配體(Aptamer)是一段特殊的DNA或RNA核酸序列，通常是基于體外篩選技術對于特定靶標分子具有高度親和性，相較于抗體成本更低。通過核酸適配體和Cas13d的結合可實現一些非核酸靶標的檢測的可能。

當前尚未見CRISPR Cas13d與適配體相結合的用于檢測cTnI的技術報道。

cTnI目前較為成熟的檢測方法為ELISA法，但是其檢測成本較高，對應的靈敏度較差。Cas13d作為一種緊湊的Cas蛋白酶，因其較小的結構，可導入腺病毒載體，從而達到體內遞送敲低mRNA的目的。但是其體外的檢測應用尚無許多報道，目前沒有基于Cas13d檢測非核酸分子的文獻報道。

發明內容

發明目的：本發明目的是提供一種精準的基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法。

本發明方法將非核酸分子信號輸入轉換為可被Cas13d識別的核酸分子信號，在cTnI ELISA檢測的基礎上，通過改變一些元件，降低cTnI的檢測限和檢測成本。

技術方案：本發明提供一種基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，包括如下步驟：